JDP2、Phf2 蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其与病理特征的相关性

彭凤翔 李 丹 高蓉梅 李永春 叶小娟

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）发病率和病死率均呈逐年上升趋势，一旦发展为晚期NSCLC，其侵袭及转移进展无法遏制且对常规化疗药物耐受性和敏感性较低，导致治疗困难［1］。研究表明，二聚化蛋白（Jun dimerization protein 2，JDP2）信号通路与肿瘤细胞增殖、分化、迁移有关，提示干扰或加强该通路可有效抑制肿瘤细胞生长［2］。恶性肿瘤疾病侵袭与转移抑癌基因、癌基因及其基因产物的调控与Phf2 蛋白过度表达有关，Phf2 蛋白在食管癌、乳腺癌及NSCLC 中均有不同表达［3-5］。本文检测NSCLC 癌组织中JDP2、Phf2 蛋白表达，采用2×2配对资料关联性分析两者关联性JDP2、Phf2 蛋白一致性，并分析其与临床病理特征相关性，以期为NSCLC 治疗和预后判断提供新的策略方案。

材料与方法

一、临床资料

经本院医学伦理会讨论并通过和患者签署知情同意书后，收集2018 年1 月至2019 年3 月我院切除并经病理证实的65 例NSCLC 标本，其中＞肿瘤边缘5 cm 的癌旁组织作为空白对照组。入选标准：①术后经病理学检查确诊为NSCLC；②年龄20 ～85岁；③入院前未接受任何抗癌治疗；④临床资料及随访资料完整；⑤既往无NSCLC 病史；⑥未合并严重创伤。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②依从性不好，不能定期随访；③合并脑血管、肝肾和造血系统等严重危及生命的原发性疾病者；④标本采集困难或标本不正确；⑤术前合并全身炎症反应或泌尿系统感染；⑥合并严重精神病或沟通障碍。 男性39 例，女性26 例；中位年龄60 岁，平均（62.32±9.30）岁，＞60 岁41 例，≤60 岁24 例；平均身体质量指数（body mass index，BMI）16.42 ～21.15 kg／m2，中位BMI 21.32 kg／m2，≤21.32 37 例，＞21.32 28 例；肿瘤直径≤3 cm 33 例，＞3 cm 32 例；分化程度：低级26 例，中级21 例，高级18 例；有肿瘤转移33 例，无肿瘤转移32 例；肿瘤TNM 分期：Ⅰ期22 例，Ⅱ期19 例、Ⅲ期24 例；病理类型：腺癌27 例，鳞癌38 例。

二、研究方法

①基线资料，包括性别、年龄、BMI、肿瘤直径、分化程度、肿瘤转移、肿瘤分期、病理类型；②取10%甲醛溶液固定好的癌组织，修剪，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋成块，切成5 μm 连续切片；二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，苏木素染色，流水冲洗；1%盐酸溶液分化数秒，流水冲洗，伊红染色；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察HE 染色结果，明确NSCLC 病理学特点；③JDP2、Phf2 蛋白表达水平：采用RM2235 组织切片机将所有包蜡组织切成4 μm 连续切片，依次采用二甲苯、柠檬酸钠缓冲液及3%过氧化氢溶液进行脱蜡、抗原修复、梯度酒精水化、PBS 缓冲液漂洗、内源性过氧化物酶活性消除；滴加小鼠抗人PAX-2、Galectin-1 多克隆抗体（浓度1∶100，购自Santa Cruz公司）4 ℃孵育过夜；PBS 漂洗，滴加即用型生物素化二抗37 ℃孵育30 min；PBS 漂洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min；PBS 漂洗，经DAB 显色试剂盒（Solarlaio）显色、苏木精复染、梯度酒精脱水，透明，中性树脂封片，DMM-440 倒置显微镜下观察JDP2、Phf2 蛋白表达；④随访情况：采用电话及门诊检查相结合方式进行随访，纳入本文后第1 年，每3 个月随访1 次，第2 年开始每6 个月随访1 次，随访至患者死亡或纳入36 个月止，记录65 例NSCLC 患者总生存率（overall survival，OS）；随访期间无人失访，能获取完整临床资料。

三、观察指标

由两名临床经验＞5 年的病理科医师采取双盲法对染色结果进行判读［6-7］：每张切片选取5 个高倍镜视野（×400），测定每个视野下JDP2、Phf2 阳性面积及平均光密度，每例最终测量值以5 个视野下阳性面积及平均光密度的平均值为准；当细胞核中出现棕黄色颗粒，即判定为阳性表达，根据阳性细胞百分率分为4 个等级：0 分：＜5%；1 分：5 ～25%；2 分：25～50%；3 分：＞50%；最终结果相乘将＜2 分判定为阴性、≥2 分判定为阳性，记录JDP2、Phf2 阳性表达率；分析JDP2、Phf2 蛋白表达水平与NSCLC 患者性别、年龄、BMI、肿瘤直径、分化程度、肿瘤转移、肿瘤分期、病理类型等临床病理特征关系；根据生存情况分为存活组和死亡组，比较2 组临床资料及JDP2、Phf2 蛋白阳性表达率。

四、统计学方法

使用SPSS 18.0 软件进行统计分析，计数资料比较采用卡方（χ2）或Fisher 确切概率法检验；Spearman 检验相关性；以P＜0.05 表示比较结果有统计学意义。

结 果

一、JDP2、Phf2 表达特征

JDP2、Phf2 蛋白主要定位于细胞核或细胞膜中，呈黄色或棕黄色颗粒，免疫组织化学染色下的阳性表达特征见图1、图2；癌旁组织中JDP2、Phf2 阳性表达率高于癌组织中JDP2、Phf2 阳性表达率（P＜0.05），见表1。

表1 JDP2、Phf2 阳性表达率（n）

图1 JDP2 在癌旁组织（左）和癌组织（右）中的表达

图2 Phf2 在癌旁组织（左）和癌组织（右）中的表达

二、JDP2、Phf2 在NSCLC 组织中共同表达的相关性分析

65 例NSCLC 组织中，33 例JDP2（＋）和Phf2（＋）同时存在，30 例JDP2（-）和Phf2（-）同时存在，1 例JDP2（＋），1 例Phf2（＋）；采用2×2 配对资料关联性分析两者关联性，结果JDP2、Phf2 在NSCLC 组织中共同表达呈负相关关系，二者具有协同作用（χ2＝53.531，P＜0.001，关联强度＝0.684）。

三、JDP2、Phf2 与NSCLC 患者临床病理特征的关系

不同年龄、性别、BMI、肿瘤直径、肿瘤病理类型的NSCLC 患者JDP2、Phf2 表达量比较无显著差异（P＞0.05）；分期Ⅲ期、出现肿瘤转移的NSCLC 患者JDP2、Phf2 阳性表达率低于分期Ⅰ／Ⅱ期、无肿瘤转移NSCLC 患者JDP2、Phf2 阳性表达率，而分化程度高级的NSCLC 患者JDP2、Phf2 阳性表达率高于分化程度低级的NSCLC 患者JDP2、Phf2 阳性表达率（P＜0.05），见表2。

四、随访期间生存结果比较

3 年随访期间存活患者42 例（64.62%），死亡23 例（35.38%）。肿瘤直径＞3 cm、TNM 分期Ⅲ期、出现肿瘤转移、JDP2 阴性、Phf2 阴性的NSCLC 患者存活率低于肿瘤直径≤3 cm、TNM 分期Ⅰ／Ⅱ期、无肿瘤转移、JDP2 阳性、Phf2 阳性的NSCLC 患者（P＜0.05），见表3。

表3 随访期间生存结果比较（n）

讨 论

JDP2 为转录活化因子1 抑制物，可对相应区域组蛋白进行转录、修饰、结合和激活，对特异性癌基因活性及其他二聚体均有一定抑制作用。研究显示，JDP2 过表达导致孕酮受体应激后细胞活力增加并促进细胞凋亡以促进特异性蛋白依赖性转录，说明其对肿瘤可能具有抑制和促进转录双重活性［8］。张裔麒元等［9-10］研究乳腺癌患者JDP2 表达量发现，JDP2 通过抑制活性氧诱导的RNA XIST 细胞转化抑制乳腺癌细胞增殖和分化，提示其可抑制肿瘤发生和发展。而也有研究通过JDP2 蛋白诱导淋巴瘤细胞因子发现，癌细胞迅速增殖且恶性迅速增强，提示JDP2 可能引起的基因组改变与疾病发展密切相关［11］。Phf2 为KDM7 新成员，作为神经元分化和颅面发育必需蛋白，已有多项报道证实其与癌症的遗传改变有关［12-13］。Zheng 等［14］指出Phf2 在淋巴瘤细胞中呈高表达水平，表明其与肿瘤发生和发展密切相关；Jeong 等［15］指出Phf2 在肾透明细胞癌中异常下调，表明其可负向调控肿瘤发生和发展；而孙翠翠、刘谦等［16-17］在探讨NSCLC 发展为晚期NSCLC危险因素中发现Phf2 为独立影响因素；Phf2 可影响肿瘤抑癌基因或癌基因激活或失活，有望为肿瘤早期诊断和及时干预提供新靶点。本文分析JDP2、Phf2 共同表达的相关性，结果显示JDP2、Phf2 在NSCLC 组织中共同表达呈负相关关系，二者具有协同作用（P＜0.001，关联强度＝0.684），提示共同检测有一定价值。

为明确JDP2、Phf2 在NSCLC 中的价值，本文选择经病理学检查明确为NSCLC 的病理标本，通过免疫组化染色观察到癌组织中的JDP2、Phf2 蛋白阳性表达率低于癌旁组织，提示低表达的JDP2、Phf2 蛋白与NSCLC 发病具有一定关系，表达缺失提示预后不良。Fang 等［18］的一项宫颈癌大样本随访资料和刘辉等［19-21］研究显示，JDP2、Phf2 阳性患者与较小肿瘤大小及TNM 低分期存在显著正相关关系，与年龄、性别、BMI、既往史等无关，且在Kaplan-Meier 生存分析中可见JDP2、Phf2 阳性表达生存率高于JDP2、Phf2 阴性表达生存率。Nakade 等［22］的一项动物体内和体外实验结果表明，JDP2 可抑制活性氧产生和DNA 氧化，提示其对瘤细胞形成具有一定抑制作用。既往认为Phf2 高表达与较年轻的年龄组、高分化及较低肿瘤分期呈显著正相关关系［23-25］，且已证实低表达Phf2 促进肿瘤分化、繁殖和发展［26］。

本文将JDP2、Phf2 表达水平与NSCLC 临床病理特征进行相关性分析，结果JDP2、Phf2 阳性表达负向调控TNM 分期和癌细胞转移，而随着分化程度的提高JDP2、Phf2 表达阳性率升高。与既往资料一致，NSCLC 患者中JDP2 表达量与年龄、性别、BMI等无关；而Phf2 对于年龄不一致仍需进一步分析，本文样本量少，选择样本数据资料有效，可能导致结果有一定误差。

表2 JDP2、Phf2 与NSCLC 患者临床病理特征的关系（n）

在NSCLC 病变早期、无淋巴转移时，JDP2、Phf2表达率高，说明PAX-2 缺失可能发生在癌症发病早期阶段，这对于早期相关分子的检测和控制有较高价值。分析其作用机制可得，JDP2 和抑癌基因具有相似结构，共同参与正常子宫内膜生长，其水平下降或缺失直接影响肺泡细胞正常生长和功能。报道指出，肺部组织正常生长功能和形态被破坏后，原癌基因和抑癌基因发生变化，诱发癌症可能性大。相关报道均对Phf2 表达水平作出证实，其在正常组织中均有表达，而一旦组织发生病变，其敏感性高于其他特异性指标，可能异常下调来对抗癌细胞浸润。JDP2、Phf2阳性患者术后三年生存率显著高于JDP2、Phf2 阴性患者，且当并存远处淋巴转移时，JDP2、Phf2 阳性患者术后三年生存率也和无转移患者无显著差异，这一研究结果证实了JDP2、Phf2 阳性对癌细胞进展和预后的预测。本文中NSCLC 恶性程度越高而JDP2、Phf2 阳性表达越低，提示JDP2、Phf2 可作为预测NSCLC 疾病进展的分子标志物。

综上所述，JDP2、Phf2 与NSCLC 临床病理分期和特征密切相关，且对生存预后有较大影响，提示对JDP2、Phf2 蛋白的检测可为NSCLC 的诊断和治疗提供新靶点。但由于本实验样本量少，且仅采用免疫组化染色法测定相关蛋白表达情况，进一步定量分析JDP2、Phf2 蛋白调控及作用机制需在日后临床实践中继续研究。