云南部分地区黑山羊的芽囊原虫分子检测及基因分型

谢世臣，邹扬，李朝,，杨建发，朱兴全，盛金良

(1 石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2 中国农业科学院兰州兽医研究所/甘肃省兽医寄生虫病重点实验室，甘肃 兰州 730046；3 云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

芽囊原虫(Blastocystis)是一种较为常见的人和动物体内消化道寄生虫。自1912年首次发现芽囊原虫以来，关于芽囊原虫的分类归属一直饱受争议，芽囊原虫曾一度被认为是鞭毛虫的包囊，随后的研究又归纳为植物和酵母菌以及真菌等物种，直到1967年Zierdt等[1]才将芽囊原虫归类为原虫。根据现有文献报道，芽囊原虫的宿主谱十分广泛，从人和非人类灵长动物、鸟类、爬行类和两栖类动物体内均检测分离到芽囊原虫的存在。其流行呈世界性分布，且具有极高的地理差异性，在贫穷落后地区及发展中国家、热带及亚热带地区有较高的感染率[2]。

有关芽囊原虫的致病性也存有一定的分歧[3]。虽然没有证据表明，人和动物产生的腹痛、腹泻等临床症状与感染芽囊原虫有直接关联。但在一些动物实验中发现，芽囊原虫通过污染水源和食物能够感染其他动物和人类，所以，芽囊原虫对低龄动物和免疫低下的动物仍具有一定的潜在致病性。在一些案例中，人和动物粪便中能够检出大量的芽囊原虫卵囊。且报道指出，芽囊原虫的感染与肠应激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)具有一定的联系。

为了阐明云南地区黑山羊感染芽囊原虫的现状和风险，进一步评估当地居民的生活环境中芽囊原虫可能存在的公共卫生安全隐患。本研究将基于芽囊原虫SSU-rRNA基因，根据分子生物学方法对采集自云南五个地区的907份黑山羊样品进行分析，研究当地黑山羊的芽囊原虫的感染情况和基因亚型种群结构。为当地预防芽囊原虫的传播提供科学数据参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

自2017年8月—10月份，从云南省楚雄州、西双版纳、丽江等3个州市5个地区共12个农场采集到云南黑山羊粪便907份，每只动物采集粪便5～10 g，对应放置于标记动物编号的15 mL采样管中，同时记录动物的性别及年龄大小，将装有粪便样品的的收集管置于装有冰袋的泡沫盒中并转运至实验室；用2.5%重铬酸钾溶液完全浸泡并保存于4 ℃冰箱待后续试验。

1.2 样本的预处理及DNA的提取

取约3 g粪便样品，使用灭菌双蒸水与超高速离心机洗去重铬酸钾，直至溶液清澈透亮。将预处理后的粪便，按照E.Z.N.A.Stool DNA Kit (OMEGA，USA) 试剂盒说明书提取DNA，得到80 μL的提取物，并利用Nano-Drop分光光度计测定提取物OD260/OD280，判定其纯度和浓度。所有DNA均储存于-80 ℃冰箱。

1.3 芽囊原虫的检测

根据参考文献[4]，在西安擎科生物公司合成引物(BhrDR-F1：5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′，GR1：5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)，按照实验室要求配制并分装引物。25 μL PCR体系如下：取14.25 μL灭菌双蒸水，2 μL的dNTPs，2.5 μL 10×Buffer (Mg2+free)，1.5 μL的MgCl2试剂，上下游引物各1 μL，模板2 μL。扩增条件：预变性：94 ℃、5min，变性：94 ℃、45 s，退火：65 ℃、45 s，延伸：72 ℃、1min，重复35个循环，再延伸：72 ℃、10 min。PCR扩增结束后，用1×TAE缓冲液配制含有浓度约为1 μg/mL的溴化乙锭(EB)的1.5%的琼脂糖凝胶。进行电泳鉴定。通过凝胶成像仪观测结果并作记录，将鉴定为PCR扩增阳性的PCR产物送至西安擎科生物有限公司进行单向测序。

1.4 芽囊原虫的基因亚型分型

对校准和拼接后的序列，用软件Mega 7.0 (https://www.megasoftware.net/)采用方法为邻接法(Neighbor-Joining，NJ)对芽囊原虫阳性的核酸序列进行构建系统发育分析进化树。选用Kimura 2-parameter模型，Bootstrap分析(采用1000个重复)用于评估系统发育树的可靠性，其它相关参考序列依照已报道的文献从Genbank数据库中获得。

1.5 数据的统计学分析

所有统计学分析均使用软件SPSS 20.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行处理。使用χ2来分析云南地区黑山羊的芽囊原虫在性别、年龄、区域间的感染率差异，当P<0.05则被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 黑山羊中芽囊原虫的流行情况

通过对907份黑山羊粪便进行普通PCR扩增，经过电泳鉴定、测序鉴定，成功扩增出375份阳性DNA，PCR扩增结果约600 bp(图1)，总体检出率为41.3%。

注：M：DNA Marker 2000；-：阴性；1表示阳性；2-8：从黑山羊粪便提取的样本DNA图1 黑山羊芽囊原虫SSU rRNA扩增结果

针对本研究检测结果对黑山羊不同地区、性别和年龄段等因素进行统计学分析(表1)。

表1 不同年龄、性别和地区间云南黑山羊的流行病学情况

西双版纳勐腊县地区，128份样本中成功鉴定出116份阳性，阳性率为90.6%，阳性率最低的地区为牟定县20.7%(30/145)。通过统计学计算发现，五个地区间感染率存在显著性差异(χ2=181.73,df=4,P<0.001)。而且，本研究发现，芽囊原虫感染率与年龄具有相关性，本试验在年龄间也具有统计学意义(χ2=17.52,df=2,P<0.001)。我们发现在个别农场中，低龄动物(1-12月龄)，呈现出完全感染，高龄动物(M≥24月)也存在普遍感染的现象。除此之外，本试验在性别间也存在统计学意义(χ2=11.69,df=1,P=0.001)。在雄性黑山羊中感染率为45.0%(285/633)，高于雌性黑山羊的32.9%(90/274)(表1)。

2.2 芽囊原虫的基因亚型分布情况

本研究中，通过对所有375份阳性样本在线Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对发现，其中有一株DSJ-11与MH201341(ST5)同源性为100%；一株DSJ-281与MF186664(ST14)同源性为100%；一株MHZ-13与MG831504(ST10)同源性为100%；其余的阳性DNA中，有157株与MG831460同源性高达99%，有127株与MG831504同源性为99%，还有82株与LT594969同源性为99%。此外，本研究发现并命名4个新亚型ST-novel 1一株，新亚型ST-novel 2一株，新亚型ST-novel 3三株，新亚型ST-novel 4一株。最后得到ST5共158份，ST10共128份，ST14共83份。

通过对不同地区间ST5、ST10和ST14分布情况分析发现，ST5是试验地区的优势基因亚型。各基因亚型在地区间的分布情况见图2。

图2 芽囊原虫基因亚型在各地区的分布

我们所分离出的4株新基因亚型ST-novel 中，ST-novel 1和ST-novel 2分离于武定县，ST-novel 3和ST-novel 4分离于西双版纳勐腊县。参考ST1-17的序列，构建系统发育分析。结果显示，ST-novel 2和ST-novel 3、ST-novel 1和ST-novel 4分别成支，而且这4种基因亚型在Blast筛选结果中差异性均>5%，单独位于进化树的一个分支上(图3)。

注：▲为本研究鉴定出的新命名的基因亚型图3 本研究中芽囊原虫系统发育分析

3 讨论

芽囊原虫(Blastocystis)是一类流行广泛的寄生性肠道原虫。其分布呈世界性，在发达国家能达到1.5%～20%,在发展中国家能达到30%～60%[5]。芽囊原虫由于基因的遗传多样性，现被分为17个亚型，记为ST1-17。其中，ST1-9被认为存在人兽共患致病风险，而ST10-17只在动物和水中所检测到，认为公共卫生意义不大。过去的大约90%的报道都认为，ST1和ST2是美国的优势亚型，ST1和ST3是澳大利亚、欧洲和亚洲东南部的优势亚型，ST4则是欧洲的优势亚型。且在不同的地域或者国家内，ST5至ST9也在人体内也被检测到。但至今为止，尚未报道有ST10至ST17在人体内所检测到，但ST10是最常见于牛、羊和骆驼等反刍动物中的。

在我国曾进行的肠道原虫感染情况调查中，芽囊原虫的感染率在西南地区维持在较高水平，西南城市地区为4.0%，西南农村地区为32.6%[6]。全国范围内的感染率比较发现，上海[7]地区的人感染率为2.95% (88/2984)，新疆人[8]感染率为0.7% (2/26886)，深圳人[9]感染率为0.4% (6/1518)。国内外有关芽囊原虫感染羊的报道较少，其中陕西省山羊[10]感染率58.0% (458/789)，安徽省[11]绵羊感染率为6.38% (22/345)，山羊为0.26% (2/781)。在国外的一些报道中，芽囊原虫也表现出了较大的地理差异性，伊朗[12]地区人患病率为14.35% (69/481),土耳其地区[13]人患病率为0.54% (275/50185)，泰国地区[14]人患病率13.5% (110/814)，马来西亚地区[15]儿童患病率为25.7% (77/300)，山羊感染芽囊原虫的感染率为30.9%。

本研究中，云南黑山羊的芽囊原虫感染率为41.3%，显著高于西南农村地区报道的32.6%，其中，尤其以勐腊县磨憨镇高达90.6%的感染率。造成这一结果的原因可能是：(1)：西双版纳勐腊县靠近国界线，与老挝接壤，进出口动物或人类可能携带，进而扩大传播。(2)：西双版纳作为云南地区养殖动物最多的几个地区之一，动物数量非常庞大；且靠近赤道，每年雨水丰富，地理因素和环境因素共同作用的结果。(3)：同时西双版纳也是云南旅游胜地，每年吸引到的游客有数百万，芽囊原虫作为一种世界性广泛分布的寄生虫，可以潜伏在人或动物体内，随着宿主动物活动范围的扩大而传播。(4)：推测主要原因可能是试验农场卫生习惯不良，经粪口途径饮用或食用受污染的水或食物。(5)：样本量太少，采样地单一所造成的误差。

由基因亚型分布情况中得知，本研究的5个地区中，除了牟定县的ST10患病数高于ST5，其余地区ST5均是试验地区的优势基因亚型，提醒我们要重视ST5可能引起的人兽共患风险[16]。在国内山羊感染芽囊原虫的调查中发现，陕西省感染芽囊原虫的山羊中以ST10作为优势基因型，其次为ST14、ST5和ST1等。安徽省和山东省感染芽囊原虫的山羊都以ST10为主要基因型，江苏省感染羊群中ST5为优势基因型。此外，有报道称ST6是亚洲各地所感染的一种普遍基因型，但本研究并没有发现ST6，推测可能与实验样本量和地区特异性有关。在马来西亚的山羊感染芽囊原虫的案例中，其优势基因型为ST1，其次为ST6、ST7和ST3，这一数据进一步证明了芽囊原虫的传播存在极高的地理差异性。

在进化树分析中，ST-novel 2和ST-novel 3、ST-novel 1和ST-novel 4分别成支，而且这4种基因亚型在Blast筛选结果中差异性均>5%，单独位于进化树的一个分支上，由此，推测这4种基因亚型可能成为新的基因亚型。至于本研究中新发现的这四种基因亚型是否有人兽共患的风险，需要后续更多地试验数据支撑。