热疗联合特异性沉默趋化因子受体4对骨肉瘤增殖和侵袭的影响

陈志达 钟渊福 陈云萍 曾宇哲 曾文容 宋超 吴进

骨肉瘤是好发于儿童及青少年的恶性原发性骨肿瘤，具有较高的局部侵袭及远处转移率［1，2］。尽管近年来采用外科手术辅助化疗的治疗方案取得了一定进展，但病人的5 年生存率也仅为55%～60%，约30%～40%的病人出现肺和骨骼转移［3］。因此，急需寻求有效的治疗靶点以突破骨肉瘤治疗和预后的瓶颈［4］。

有研究证实，趋化因子受体4（chemokine recep⁃tor 4,CXCR4）在多种肿瘤细胞中高表达，并在其增殖和迁移中发挥重要作用，而在相应来源的正常细胞中不表达［5⁃8］。热疗已被应用于许多肿瘤放化疗的辅助治疗。随着分子生物学技术的发展和应用，热疗被认为是某些基因治疗的增强剂［9⁃11］。然而，目前关于热疗联合特异性沉默CXCR4 对骨肉瘤细胞影响的研究较少。本研究通过特异性siRNA 沉默CXCR4的表达，同时联合热疗观察其在骨肉瘤增殖和侵袭中的协同作用，初步探讨可能的调控机制。

材料与方法

一、实验动物、材料、试剂及仪器

雌性无胸腺BALB/c 裸鼠（4～6 周），体重为15～20 g，由厦门大学实验动物中心提供，并在无特定病原体级实验室独立通气系统内饲养。人骨肉瘤细胞株MG⁃63购自中国科学院细胞库。DMEM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco 公司，CCK⁃8试剂盒购自日本Dojindo公司，细胞裂解液购自美国Invitro⁃gen公司，CXCR4和GAPDH抗体购自英国Abcam公司，siRNA购自美国Sigma公司，Matrigel胶购自美国BD 公司，ECL 显色试剂盒均购自美国Millipore 公司。免疫荧光试剂盒购自美国Focus公司。实时荧光定量聚合酶链反应（real⁃time quantitative poly⁃merase chain reaction,RT⁃qPCR）所需的引物设计由上海生工生物技术有限公司完成。GeneAmp 2400 PCR 仪购自美国ABI 公司，HH-2-恒温水浴锅购自常州万科仪器科技有限公司，M200多功能酶标仪购自瑞士Tecan 公司，凝胶成像系统购自美国Alpha Innotech公司。

二、实验方法

（一）细胞培养及转染

将MG⁃63 细胞接种于DMEM 培养基（含15%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素）培养，并置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培养，3～4 d传代。取对数生长期的MG⁃63细胞制成细胞悬液（1×106个/ml）。

预先进行转染效能检测，将细胞悬液500 μl 接种于6 孔板中，待细胞密度达80%时，应用CXCR4 siRNA 转染细胞，同时设置control siRNA 组和空白组（不转染任何试剂）。转染24 h 后采用Western blot检测CXCR4的表达变化。

完成转染效能检测后，将细胞接种于6孔板中，设置control siRNA 组（对照组）、热疗联合CXCR4 siRNA组（联合组）、CXCR4 siRNA组（沉默组）和热疗组，每组3 孔。以CXCR4 siRNA 转染沉默组和联合组的细胞，control siRNA转染对照组细胞，热疗组和联合组进行热疗处理。联合组转染24 h后进行热疗，热疗的操作方法为将细胞置于43 ℃水浴加热1 h。各组细胞放入37 ℃、5%CO2孵育箱中继续培养。

（二）RT⁃qPCR检测mRNA的表达

干预24 h 后收集各组的细胞，采用Trizol 试剂分别裂解并提取总RNA，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，CXCR4正向引物序列为5′⁃CGGAATTC⁃CAGCAGGTAGCAAAGTGACG⁃3′，反向引物序列为5′⁃GACGCCAACATAGACCACCT⁃3′。反应体系：0.5 μl cDNA 模板，7.5 μl DEPC 水，10.0 μl SYBR Green 染料，上下游引物各1.0 μl，共计20 μl。反应条件：预变性94 ℃4 min；变性94 ℃45 s；退火54 ℃45 s；延伸72 ℃45 s，循环30 次。用β⁃actin 作为内参，以2－△△Ct的值表示目的基因的mRNA表达水平。

（三）Western blot检测蛋白的表达

MG⁃63 细胞经不同分组处理24 h 后，取5×107～6×107个对数生长期细胞，采用4 ℃预冷的细胞裂解液裂解细胞30 min 后，4 ℃下15 000 r/min 离心10 min。取上清液，用二锌可酸法测定蛋白浓度后，将样品置于沸水浴5 min，加样，行12%SDS⁃PAGE 电泳2 h，电转膜仪30 V 湿法转膜1.5 h。用含5%PBST 室温孵育1 h，分别用CXCR4 和GAPDH 抗体孵育，4 ℃过夜。以PBST 冲洗3 次（10 min/次），分别加入相对应的二抗室温孵育1.5 h。用PBST洗涤3 次（10 min/次），采用ECL 显色法显影，内参为GAPDH，用凝胶成像分析软件分析条带灰度。各组目的蛋白的相对表达水平=目的蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值。

（四）CCK⁃8法检测细胞存活率

取100 μl 细胞悬液（3×103个/ml）均匀接种于96 孔培养板中，每组设6 个复孔，以无血清培养基培养12 h后，各组采用和上述步骤相同的方式干预细胞。培养箱继续培养96 h 后，加入CCK⁃8 试剂10 μl/孔，继续孵育1 h后终止培养，在酶联免疫监测仪上测定各孔450 nm波长处的吸光度值，比色时以空白对照孔调零。细胞存活率=实验组吸光度值/阳性对照吸光度值×100%。

（五）Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

MG⁃63 细胞分组处理24 h 后，将Transwell 小室放入24孔板中，每孔设置3个复孔，取50 μl/孔融解的Matrigel胶与无血清培养基混合后均匀加入Tran⁃swell 小室底部中，4 ℃下风干，37 ℃培养箱孵育2～4 h。将贴壁细胞生长至对数生长期消化，制成无血清单细胞悬液（2×105/孔），均匀加入上室中，在下室加入600 μl含10%FBS培养基中继续培养24～48 h，取出小室，PBS 清洗3 次后，用多聚甲醛进行固定，结晶紫进行染色。用棉签小心擦拭小室内部残余的Matrigel胶和细胞，光学显微镜下镜检计数。

（六）流式细胞仪检测细胞周期

取不同分组的MG⁃63 细胞处理24 h 后，经0.125%的胰酶消化后，收集单细胞悬液，调成密度为1×106个/ml，用4℃PBS 洗脱2 次，置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培养30 min，碘化丙啶单染法进行细胞周期检测。然后在流式细胞仪进行检测，采用Cell Quest 软件分析各组的细胞周期的变化。

（七）裸鼠成瘤实验

实验动物选取48只雌性BALB/c裸鼠（6～8周），随机分为4组（联合组、沉默组、热疗组、对照组），每组12 只。取对数生长期的MG⁃63 细胞，用0.02%EDTA 和0.125%的胰蛋白酶联合消化，收集细胞用无血清α⁃MEM定容。按细胞密度为1×105个/ml接种500 μl于裸鼠的左后肢背侧。MG⁃63骨肉瘤荷瘤裸鼠模型建立后，联合组将裸鼠全麻（2%的戊巴比妥钠溶液按体重40 μg/g 腹腔注射），将负瘤肢体浸入43 ℃水浴中1 h，同时以风扇降温以减少全身热反应对实验的影响；热疗2 d后，注射CXCR4 siRNA。对照组只注射control siRNA；热疗组只进行热疗，方法同联合组；沉默组只注射CXCR4 siRNA，不进行热疗。给予处理后，每天观察裸鼠状态，每周测量肿瘤的长度（L）和宽度（W），计算肿瘤体积，绘制生长曲线。按如下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积=L×W2/2。5周后处死裸鼠，称量移植瘤重量。

三、统计学方法

采用SPSS 20.0软件（IBM公司，美国）对结果进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、CXCR4 siRNA抑制CXCR4表达

Western blot 结果见图1，空白组、control siRNA组和CXCR4 siRNA 组MG⁃63 细胞CXCR4 蛋白的相对表达水平分别为1.00±0.04、0.98±0.03 和0.44±0.05，CXCR4 siRNA 组可以有效沉默MG⁃63 细胞中CXCR4 蛋白的表达，明显低于其在空白组和control siRNA 组中的表达，差异均有统计学意义（P 均＜0.05）。

二、热疗联合CXCR4 siRNA抑制CXCR4表达

RT⁃qPCR 结果提示对照组、联合组、沉默组、热疗组的CXCR4 mRNA 的表达量分别为1.00±0.04、0.37±0.03、0.63±0.04 和0.71±0.02；热疗联合CXCR4 siRNA 可以有效沉默MG⁃63 细胞中CXCR4 mRNA的表达，明显低于其他三组中的表达，差异均有统计学意义（P均＜0.05，图2）。Western blot检测结果也同样证实了联合组中CXCR4 蛋白的表达量显著低于其他三组，差异均有统计学意义（P 均＜0.05，图3）。

图1 Western blot检测CXCR4蛋白的表达

三、热疗联合CXCR4 siRNA表达对骨肉瘤细胞增殖的影响

CCK⁃8结果见图4，对照组、联合组、沉默组和热疗组MG⁃63 细胞的存活率分别为（100.00±7.33）%、（39.94±2.86）%、（69.07±4.61）%和（66.53±3.20）%；与对照组、沉默组和热疗组相比，联合组的骨肉瘤细胞存活率明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

四、热疗联合CXCR4 siRNA对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响

Transwell 侵袭实验结果显示，对照组、联合组、沉默组和热疗组的侵袭细胞数分别为（215.41±18.93）个、（44.56±18.53）个、（86.56±17.75）个和（84.74±9.57）个，联合组的侵袭细胞数均显著低于对照组、沉默组和热疗组（P均＜0.05，图5）。

图2 RT⁃qPCR检测CXCR4 mRNA在MG⁃63细胞中的表达（与其他三组比较，*P均＜0.05）

图3 Western blot检测结果

图4 CCK⁃8检测MG⁃63细胞增殖的结果（与其他三组比较，*P均＜0.05）

五、热疗联合CXCR4 siRNA对骨肉瘤细胞周期的影响

流式细胞仪结果见图6，对照组细胞G0/G1 期比例为（34.78±2.26）%，S 期比例为（55.84±2.72）%；联合组细胞G0/G1 期比例为（71.13±3.52）%，S 期比例为（25.37±2.62）%；沉默组细胞G0/G1 期比例为（47.45±2.54）%，S 期比例为（47.40±3.51）%；热疗组细胞G0/G1 期比例为（43.43±3.72）%，S 期比例为（46.38±1.38）%。与对照组、沉默组和热疗组相比，联合组可阻滞MG⁃63细胞周期于G0/G1期并减少S期细胞的比例。

六、热疗联合CXCR4 siRNA对裸鼠骨肉瘤生长的影响

体内实验结果显示，从第14 天起，联合组裸鼠骨肉瘤体积逐渐小于对照组、沉默组和热疗组，差异均有统计学意义（P 均＜0.05，图7）。5 周后处死裸鼠，对照组、联合组、沉默组和热疗组的瘤重分别为（1.62±0.11）g、（0.38±0.03）g、（0.57±0.08）g 和（0.62±0.14）g，联合组瘤重低于对照组、沉默组和热疗组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

讨 论

图5 热疗联合沉默CXCR4对骨肉瘤细胞侵袭的影响 a：对照组；b：联合组；c：沉默组；d：热疗组

图6 流式细胞仪检测热疗联合沉默CXCR4对骨肉瘤MG⁃63细胞周期的影响

图7 裸鼠骨肉瘤生长折线图（与其他三组比较，*P均＜0.05）

CXCR4是一组促炎化学介质，主要通过结合靶细胞细胞膜表面上特异性的G 蛋白受体，从而起到调控细胞运动黏附、穿越内皮细胞及向组织间隙扩散的过程［12］。在趋化因子中，基质衍生因子-1（stro⁃mal derived factor,SDF⁃1）在调控肿瘤干细胞与胚胎干细胞迁移及生长中起着重要的作用，并能高度地特异结合其唯一受体CXCR4［13］。SDF⁃1/CXCR4 的主要作用包括诱导细胞运动、趋化反应、黏附、分泌血管生成因子，最初主要集中在HIV 感染的发病机制，最近已被证明是多种肿瘤转移过程中的关键因素之一，包括卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌和膀胱癌［14⁃17］。进一步的研究发现其在非小细胞肺癌、宫颈癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞系和肿瘤组织中高表达，而在相应来源的正常细胞和组织中通常不表达或低表达［18］。CXCR4 与骨肉瘤的关系也一直是一个研究热点。Lu 等［19］通过抑制CXCR4/SDF⁃1 通路阻止骨肉瘤细胞的转移，证明CXCR4/SDF⁃1参与骨肉瘤的转移过程。Laverdiere 等［20］在骨肉瘤标本中检测到CXCR4 的mRNA 表达水平增高与病人总生存率降低相关，他们认为CXCR4可以作为骨肉瘤转移的潜在预测因子。Perissinotto等［21］发现CXCR4可能是化疗药物的潜在靶点，CXCR4拮抗剂消除了骨肉瘤的肺转移。以上研究表明，CXCR4在肿瘤转移中起着关键作用，使其成为肿瘤基因治疗的新靶点。

癌细胞对热疗的抵抗力普遍较低，热疗被认为是继手术、放疗、化疗和生物治疗之后的第五种肿瘤治疗方法。据报道某些转移相关基因如血管内皮生长因子、膜型1-基质金属蛋白酶等的表达均能被高温抑制［22，23］。此外，热疗还可以抑制肿瘤生长和淋巴结转移［24］。热疗广泛应用于骨肉瘤的研究和治疗，以往的研究表明，高温可诱导体外骨肉瘤细胞凋亡，改变骨肉瘤细胞的生物活性［25］。因此，热疗是治疗骨肉瘤的一种有效的方法。放疗或化疗与热疗相结合已被广泛应用于癌症治疗。目前，关于热疗和siRNA联合作用于肿瘤细胞的报道还很少。为了证实热疗和特异性siRNA 沉默CXCR4 对人骨肉瘤细胞的联合作用，以及热疗是否可以作为基因治疗的增强剂，我们通过RT⁃qPCR、Western blot 检测人骨肉瘤细胞在高温和转染siRNA 后的生长和侵袭能力，结果表明联合组可以有效沉默MG⁃63 细胞中CXCR4 mRNA 的表达，明显低于其在对照组、沉默组和热疗组中的表达。进一步的实验结果表明热疗联合CXCR4 siRNA 抑制骨肉瘤细胞增殖和裸鼠骨肉瘤生长，阻滞细胞周期于G0/G1 期。体内实验结果显示，从第14 天起，联合组裸鼠骨肉瘤体积逐渐小于对照组、沉默组和热疗组。接种5周后，联合组瘤重为（0.38±0.03）g，低于其他三组。这说明热疗联合特异性沉默CXCR4抑制了骨肉瘤增殖和侵袭。

综上所述，CXCR4作为癌基因参与了骨肉瘤增殖和侵袭恶性表型，热疗联合特异性沉默CXCR4能够抑制骨肉瘤的增殖和侵袭。但本研究尚缺乏深入的CXCR4 相关分子机制及信号通路的研究。随着研究的不断深入，CXCR4可能作为一个有效的骨肉瘤基因治疗新方法。