乳酸菌富硒优化及其活性评价

易鑫，周琦，欧阳祝，谈安群，范佳莹，李则灵，朱霞建，黄林华，李贵杰，王华

(西南大学 柑桔研究所，中国农业科学院柑桔研究所，重庆，400712)

硒是维持人体健康生长的必须微量元素，是合成谷胱甘肽酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,GSH-Px2)等多种酶活性中心组成部分[1]。硒在增强免疫能力、促进生殖能力、抗氧化抗癌等方面也具有突出效果[2-3]。人体主要通过摄入谷物、水果、蔬菜、肉类等来吸收硒，但在这些食物中硒含量不足以满足55 μg/d的推荐摄入量[4-5]。因此，可通过补硒的形式来调节硒的摄入量。补硒的来源主要有无机硒和有机硒，无机硒不易被机体吸收且存在潜在毒性；有机硒安全性高，易吸收，环境污染小，受到更广泛的关注[6-7]。然而，自然界中有机硒含量少，合成成本高昂。因此，如何通过廉价且高效的方式来得到有机硒成为当今的研究热点。

因此，本文以5种常用于发酵食品的乳酸菌为实验菌，分析它们对无机硒的耐受性。在此基础上筛选出1株富硒优势乳酸菌，通过单因素实验及响应面优化得到最佳的富硒培养条件，并探究富硒后乳酸菌在模拟胃肠道消化中的活性情况，以获得富硒乳酸菌的相关数据，为后续研究富硒乳酸菌发酵食品提供实验数据支撑。

1 材料与方法

1.1 菌种和试剂

植物乳杆菌(LactobacillusplantarumCICC 20265)、鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusCICC 20257)、嗜酸乳杆菌(LactobacillusacidophilusCICC 20709)、嗜热链球菌(StreptococcusthermophilusCICC 6220)；保加利亚乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii.subspbulgaricusCICC 20249)，中国工业微生物菌种保藏管理中心；MRS培养基、乙二胺四乙酸二钠盐(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)，大连美仑生物技术有限公司；亚硒酸钠(分析纯),美国sigma公司；3,3′-二氨基联苯胺(3′3-diaminbenzidine,DAB)、叔丁醇，上海麦克林生化科技有限公司；胃蛋白酶、猪胆盐，上海源叶生物科技有限公司；胰酶，合肥博美生物科技有限责任公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1F洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱，苏州市培英实验设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TU-1901紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；LGJ-10型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；SU3500扫描电子显微镜、MC1000磁控溅射器，日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化和生长曲线的测定

将各菌种挑取单菌落接种到液体MRS培养基，置于37 ℃恒温培养箱静置培养24～48 h，活化3代备用。将活化好的菌种以1%的接种量接入5 mL MRS液体培养基中，37 ℃静置培养，每隔2 h取出1支试管放置于4 ℃保存，24 h后全部取出采用光电比浊法测定菌液的OD600nm值，并绘制生长曲线。

1.3.2 耐硒菌株的筛选

菌株复壮纯化后，挑取单菌落转接入MRS培养基培养至对数中后期。以1%的接种量分别接入含亚硒酸钠质量浓度为0、10、20、30、40、50 μg/mL的MRS培养液中进行筛选，37 ℃培养 24 h，观察菌体情况，结合菌落数变化，挑选出生长旺盛且耐硒菌株。

1.3.3 硒含量的测定

1.3.3.1 标准曲线的绘制

硒含量测定参考杨靖鹏等[13]的方法稍作修改。准确吸取10 μg/mL 的亚硒酸钠标准溶液0、1、2、3、4、 5 mL 分别加到50 mL烧杯中，加水至35 mL，再加入1 mL 5% EDTA-2Na溶液，摇匀，并用体积比1∶1的盐酸调节pH值至2.5左右，各加0.5% DAB溶液4 mL，摇匀，置于暗处反应30 min，再用5% NaOH调节pH值至中性，加入分液漏斗中，并加入10 mL二甲苯振荡2 min，静置分层，去水层，收集有机层于比色皿中，于420 nm处测定吸光值，绘制标准曲线。

1.3.3.2 残留无机硒含量的测定

将发酵液8 000 r/min 离心15 min，取2 mL上清液于50 mL烧杯中，加水至35 mL，以下步骤同标准曲线绘制，同时以未富硒组做空白对照。用空白对照调零，测定样品吸光值，所得数据在标准曲线上查出相应的硒含量，此为残留的无机硒含量。根据公式(1)计算富硒率：

(1)

1.3.4 植物乳杆菌富硒培养单因素及响应面实验

1.3.4.1 盐浓度对植物乳杆菌富硒的影响

配置含亚硒酸钠质量浓度为15 μg/mL的MRS 培养基，接种3%的菌液，在盐质量浓度为0、1、2、3、4 g/100mL下37 ℃恒温静置培养24 h，测定富硒率和生物量，以确定最佳盐浓度。

1.3.4.2 亚硒酸钠浓度对植物乳杆菌富硒的影响

配置含NaCl质量浓度2 g/100mL，亚硒酸钠浓度分别为5、10、15、20、25 μg/mL的MRS培养基，接种3%的菌液，37 ℃恒温静置培养24 h，测定富硒率和生物量，以确定最适亚硒酸钠浓度。

1.3.4.3 接种量对植物乳杆菌富硒的影响

分别以1%、2%、3%、4%、5%的接种量接种于NaCl质量浓度为2g/100mL和亚硒酸钠浓度为15 μg/mL的MRS液体培养基中进行富硒培养，37 ℃恒温静置培养24 h，测定富硒率和生物量，以确定最佳接种量。

1.3.4.4 响应面法优化富硒培养条件

基于单因素实验的结果，以盐浓度、亚硒酸钠浓度、接种量3个因素为自变量，采用Box-Behnken设计3因素3水平响应面优化试验。

1.3.5 扫描电镜分析富硒乳酸菌表观结构

将获得的富硒植物乳杆菌6 000 r/min 离心20 min去上清，加入2.5%(体积分数)戊二醛4 ℃固定，离心去上清。用pH 7.2的PBS缓冲液清洗，乙醇梯度洗脱，离心去上清再用叔丁醇置换乙醇，随后冷冻干燥。最后，样品喷金后进行扫描电镜分析。

1.3.6 富硒乳酸菌模拟胃肠道耐受能力的测定方法

1.3.6.1 人工胃肠液的制备

模拟人工胃肠液参考GUO等[14]和MARTNEZ[15]的方法，稍作修改。

人工胃液，在pH值为2.0、3.0、4.0的无菌PBS缓冲液中，分别加入10%(体积分数)胃蛋白酶，充分溶解后，用无菌的0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后4 ℃备用。

人工肠液：在pH为8.0的无菌PBS缓冲液中，加入10%(体积分数)胰蛋白酶和0.15%(体积分数)胆汁盐，充分溶解后，用无菌的0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后4 ℃过夜备用。

1.3.6.2 富硒乳酸菌模拟胃肠液消化耐受力测定

将植物乳杆菌和富硒植物乳杆菌培养24 h后，离心去上清液后再加生理盐水重悬，以10%体积分数接种到上述不同pH的人工胃液中，于37 ℃、100 r/min恒温摇床中消化4 h，每隔1 h取样，采用平板菌落计数法测定活菌数，每个处理重复3次。然后，从上述已消化2 h、pH 3.0的人工含菌胃液中取1 mL，加入到9 mL人工肠液中，在37 ℃、100 r/min恒温摇床中继续培养。在0、1、2、3、4、6、8 h取样，用平板菌落计数法测定活菌数，每个处理重复3次。

1.3.7 数据统计与分析

所有实验均重复3次，试验数据以“Mean±SD”表示，用Design-Expert 8.0.6进行响应面设计和结果分析，用 Origin 2017 软件进行作图，通过SPSS 22.0统计软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌生长曲线及加硒时间的确定

5种乳酸菌生长曲线如图1所示，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌在3 h后进入对数期，持续到12 h；鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌在3 h后进入对数期，持续到8 h。嗜热链球菌在4 h后进入对数期持续至10 h。有研究证明，乳酸菌富硒转化率与加硒时间有关，乳酸菌处于对数期时其生长代谢旺盛，富硒能力强，有机硒转化率相比于其他时期更高[13, 16]。而加硒时间越早，对菌体的生长代谢抑制作用越强，不利于有机硒和单质硒的转化[17]。因此选择菌株对数期富硒，根据本研究确定植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌在6 h添加亚硒酸钠，嗜热链球菌在7 h添加亚硒酸钠。

图1 五种乳酸菌生长曲线Fig.1 Growth curves of 5 strains of lactic acid bacteria

2.2 耐硒菌的筛选

将5种乳酸菌分别培养至对数期，在含亚硒酸钠质量浓度为0、10、20、30、40、50 μg/mL的MRS液体培养基中培养24 h后，菌体颜色变化如图2所示。通过观察发现随着亚硒酸钠的浓度升高，部分菌体逐渐变红。这种现象是乳酸菌内部的一种解毒过程，即将无机硒转化为有机硒，而过量的无机硒则被转化为红色的单质硒[5]。有研究证明红色单质硒对人体有诸多益处，但红色单质硒有强烈的金属味，会严重影响发酵食品的风味[9, 18]。因此本实验选择菌泥为微红色适宜。由图2可知随着亚硒酸钠浓度的升高，5种乳酸菌的菌落数均出现减小，这是因亚硒酸钠浓度过高对菌株产生了抑制作用[18]。但植物乳杆菌的菌落数在不同亚硒酸钠浓度下都高于其余4种乳酸菌。综上，结合图2和表1数据，筛选出富硒优势菌为植物乳杆菌。

a-植物乳杆菌；b-鼠李糖乳杆菌; c-嗜热链球菌;d-保加利亚乳杆菌; e-嗜酸乳杆菌图2 五种乳酸菌在不同亚硒酸钠浓度下培养24 h后菌体颜色变化Fig.2 Color change of 5 lactic acid bacteria were cultured at different concentrations of sodium selenite for 24 h

表1 不同浓度下亚硒酸钠对乳酸菌生长情况的影响Table 1 Effect of different concentration sodium selenite on LAB growth

注：小写字母表示同一行显著性差异(P<0.05),大写字母表示同一列显著性差异(P<0.05)

2.3 单因素实验结果

2.3.1 盐浓度对植物乳杆菌富硒效果的影响

由图3可以得到，随着NaCl浓度的增加，植物乳杆菌生物量不断升高，富硒率在盐质量浓度为2 g/100mL时达到最大，为83.23%。与徐颖等[19]的研究相似，发现在一定盐浓度胁迫下，能增加鼠李糖乳杆菌的富硒量。这可能是由于乳酸菌在盐胁迫下，外界渗透压增大，自身通过诱导相关酶表达，从而增加谷氨酸、脯氨酸、甜菜碱和甘氨酸等可溶性溶质的生成来缓解外界的高渗透压，以保持细胞内外平衡。而这些可混溶性溶质合成的关键酶如甘氨酸还原酶、脯氨酸还原酶、甜菜碱还原酶都是硒蛋白酶[20]。因此盐胁迫促进了乳酸菌对硒的转化作用。

图3 盐浓度对富硒效果的影响Fig.3 Effect of salt concentration on selenium enrichment

2.3.2 亚硒酸钠浓度对植物乳杆菌富硒效果的影响

由图4可知，随着亚硒酸钠质量浓度的增加，植物乳杆菌的生物量从2.626 g/L 降低到2.062 g/L，说明亚硒酸钠对乳酸菌有一定的抑制作用。但随着亚硒酸钠质量浓度增加富硒率出现升高后降低再升高的趋势，结合乳酸菌的生物量变化，这可能是由于亚硒酸钠质量浓度逐渐增加，导致乳酸菌出现病理性富硒，即菌体自身代谢遭到破坏[21]。综合考虑选择亚硒酸钠质量浓度15 μg/mL。

图4 亚硒酸钠浓度对富硒效果的影响Fig.4 Effect of sodium selenite on selenium enrichment

2.3.3 接种量对植物乳杆菌富硒效果的影响

如图5所示，随着接种量的增加，植物乳酸菌的生物量也随之增加，富硒率在接种量为3%时，达到最大值82.63%，随后富硒率下降，这是因为随着接种量增加培养基中营养成分也被大量消耗，在培养后期菌体之间相互竞争，富硒含量反而下降[22]。因此选择3%的接种量。

图5 接种量对富硒效果的影响Fig.5 Effect of inoculation amount on selenium enrichment

2.4 响应面结果分析

2.4.1 响应面设计方案与实验结果

以单因素试验结果为依据，采用响应面法对盐质量浓度、亚硒酸钠质量浓度、接种量3个因素进行3因素3水平的响应面设计与分析，各因素水平如表2所示，试验设计及结果如表3所示。

表2 响应面试验因素及水平Table 2 Factors and levels of response surface in fermentation process

2.4.2 模型的建立及显著性分析

表3 响应面设计方案及结果Table 3 Response surface design scheme and results

表4 回归模型方差分析表Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

注： *，P< 0.05，差异显著；**，P< 0.01，差异极显著

2.4.3 响应面分析

根据回归方程，得到各因素交互作用对植物乳酸菌富硒率的响应面图和等高线图。通过等高线的线密度以及形状可以反映交互作用的强弱，即等高线越密集且趋近椭圆形表明两因素交互作用显著，反之则不显著[23]。由图6-a可知，通过等高线可以得到因素A和因素B交互作用对植物乳酸杆菌富硒率影响较显著(P<0.05)；由6-b可知，当接种量不变时，随着亚硒酸钠质量浓度的增加，富硒率先升高后降低，随着盐质量浓度增加，富硒率上升后缓慢下降，亚硒酸钠质量浓度的曲面要陡一些，因此亚硒酸钠对富硒率的影响比盐质量浓度要更显著一些。由图6-c可知，等高线可得到因素B和因素C交互作用对富硒率有极显著影响(P<0.01)。由图6-d可知，在盐质量浓度一定的情况下，随着亚硒酸钠质量浓度和接种量的增加，富硒率先升高后降低，在接种量2.5%～3.5%出现峰值，在亚硒酸钠质量浓度16～20 μg/mL之前出现峰值，即为富硒率最高的接种量、亚硒酸钠质量浓度条件。

a-因素A和因素B交互作用等高线图；b-因素A因素B交互作用响应面图；c-因素B和因素C交互作用等高线图；d-因素B因素C交互作用响应面图图6 各因素交互作用对植物乳杆菌富硒率影响的等高线图和响应面图Fig.6 Response surface and contour polts showing the effect of various factors on rate of Lactobacillus plantarum Se-enriched

2.4.4 验证试验

通过响应面进行分析，得到最佳富硒率条件为：盐质量浓度2.33 g/100mL，亚硒酸钠质量浓度16.56 μg/mL，接种量2.91%，此条件下计算最佳富硒率为84.66%。综合实际操作，将条件修正为盐质量浓度2 g/100mL，亚硒酸钠质量浓度16 μg/mL，接种量3%。最终得到富硒率为84.26%，与理论值接近，证明该模型可靠。

2.5 富硒植物乳杆菌菌体扫描电镜分析

SU3500型扫描电子显微镜对富硒后的植物乳杆菌进行表面结构观察，结果如图7所示。在未富硒条件(图7-a)，植物乳杆菌表面光滑，呈现短杆状。富硒植物乳杆菌(图7-b)表面有单质硒析出，此外与未富硒组无显著变化。MARTNEZ等[15]在研究中也发现富硒短乳杆菌周围出现纳米硒微球，这是由于乳酸菌能够将无机态的硒还原成单质硒。同时与杨靖鹏等[13]在富硒乳酸菌扫描电镜相比，植物乳杆菌在富硒后未出现变形、表面粗糙等现象。说明在该条件下植物乳杆菌富硒效果很好，较高的保持原有的形状且有少量单质硒析出。

a-未富硒植物乳杆菌菌体细胞;b-富硒植物乳杆菌菌体细胞图7 植物乳杆菌富硒前后扫描电镜图Fig.7 Microphotographs of before and after selenium enriched of Lactobacillus plantarum注：图7-b中红圈为单质硒

2.6 富硒植物乳酸菌在模拟胃肠道耐受能力的测定

2.6.1 富硒植物乳杆菌人工胃液消化过程

正常人体胃液pH值在1.5～4波动，胃排空一般在3～5 h[14]。本实验将富硒植物乳杆菌和植物乳杆菌分别在pH 2、 3、 4下消化4 h观察其菌落数及存活率的变化。如图8-a所示，在pH值为2时，富硒组和未富硒组菌落数均急剧下降，4 h后富硒组菌落数由8.58 lgCFU/mL降至7.98 lgCFU/mL，未富硒组菌落数由8.8 lgCFU/mL降至8.13 lgCFU/mL，富硒组存活率为25.55%，显著大于未富硒组存活率20.70%(P<0.05)。图8-b所示，在pH值为3时，在4 h内富硒组和未富硒组活菌数和存活率较pH 2明显上升，富硒组存活率达到44.03%，未富硒组达40.04 %(P<0.05)。如图8-c所示，pH值为4时，富硒组活菌数由8.51 lgCFU/mL降至8.19 lgCFU/mL，空白组活菌数由8.8 lgCFU/mL降至8.43 lgCFU/mL，存活率富硒组为46.16 % 显著大于未富硒组43.66 %(P<0.05)。

2.6.2 富硒植物乳杆菌人工肠液消化过程

人体肠液含有大量的水分和各种酶、胆汁盐等物质，pH值在7.5左右，对肠道菌群有一定的阻力[25]。固体或液体食物在小肠一般6～8 h消化完毕[24]，本实验将消化2 h的pH 3含菌人工胃液继续加入到人工肠液中继续消化，消化8 h观察其存活情况，结果如图8-d所示。随着时间的推移，富硒组和未富硒组在胰酶消化和胆盐抑制下菌落数不断降低，富硒组由8.29 lgCFU/mL降至7.34 lgCFU/mL；空白组由8.45 lgCFU/mL降至7.46 lgCFU/mL。存活率富硒组8 h后降至12.32%，空白组存活率为10.23%。

富硒植物乳杆菌在不同pH胃液和肠液都表现出比未富硒有更强的存活率，且消化后活菌数达到6 lgCFU/mL以上，达到了益生菌食品要求的活菌数量值[26]。这一结论与MARTNEZ等[15]研究相似，对比富硒和未富硒的短乳杆菌CRL 2051发酵果蔬汁后，在模拟胃肠液消化下，富硒短乳杆菌表现更高的存活率。ALZATE等[9]在研究富硒乳酸菌发酵乳中也发现富硒后的保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌在发酵4周后比未富硒组具有更高的存活率。结合图7扫描电镜图分析，推测富硒乳酸菌表现出较强存活率可能与菌体富硒后析出的单质硒有关，单质硒依附在菌体周围使其具有较强的耐受能力。

a-人工胃液pH 2；b-人工胃液pH 3；c-人工胃液pH 4；d-人工肠液图8 富硒植物乳杆菌在不同pH人工胃液和肠液中消化过程的活菌数Fig.8 The viable counts of Se-enriched Lactobacillus plantarum during digestion in artificial gastric and intestinal juices at different pH levels注： *， P < 0.05，差异显著；**， P < 0.01，差异极显著

3 结论

本实验测定了5种常用于发酵食品的乳酸菌生长曲线，确定适宜的加硒时间，通过观察乳酸菌菌体情况，结合菌落数变化，筛选出植物乳杆菌为耐硒菌。进一步优化富硒条件，确定植物乳杆菌最佳富硒条件为NaCl质量浓度2 g/100mL，亚硒酸钠质量浓度16 μg/mL，接种量为3%。最终富硒率为84.26%，与理论值84.66%接近。从扫描电镜结果分析，该条件下富硒植物乳杆菌与未富硒植物乳酸菌表面无明显差异，经富硒后表面有少量单质硒析出。且在模拟胃肠液消化后，发现富硒植物乳杆菌存活率显著高于未富硒组(P<0.05)，具有更强的耐受性。综上所述，在该优化条件下植物乳杆菌富硒效果好，且能保持较高的活性，为后续研究富硒乳酸菌发酵食品提供了实验数据支撑。