顶空固相微萃取-气质联用法研究油麦菜采后香气成分的变化

李雪，韩燕，许晶冰，张玲*，高飞虎，梁叶星*，张雪梅，杨世雄，张欢欢

1(重庆市农业科学院，农产品贮藏加工研究所，重庆，401329)2(重庆市食品药品检验检测研究院，重庆，401121)

油麦菜(Lactucasaticavar.longifoliaf. Lam)属菊科、莴苣属，是长叶莴苣的一个变种，它不仅口感脆嫩，口味鲜甜，且营养丰富，是生食蔬菜中的佳品[1]。油麦菜具有与一般叶菜不同的特殊清香风味，是我国最受欢迎的叶类蔬菜之一[2]，在我国生鲜蔬菜领域占有重要地位，市场前景广阔。

目前对油麦菜贮藏保鲜技术与品质影响因素研究较多[3-4]，而鲜见对其主要香气成分以及其贮藏过程中香气成分变化的研究。油麦菜的特征清香味在采后贮藏过程中变化明显，这是由于油麦菜采后呼吸和蒸腾作用旺盛，营养物质消耗较快，挥发性香气成分变化较大[1]。蔬菜中挥发性物质含量较低、还存在累加、分离以及抑制等相互作用[5-6]，需对其组分先分离后再进行富集处理。固相微萃取是一种不需要对样品进行溶剂提取的前处理技术，其将采样、萃取、浓缩和进样过程融为一体，具有操作简单、快速等优点，已应用于荠菜[7]、番茄[8]、黄瓜[9]、胡萝卜[10]等蔬菜香气成分分析。

随着生活水平的提高，人们对生鲜蔬菜的鲜活性也提出了新的要求，要求既能保持蔬菜外观新鲜，又能保留现摘蔬菜的风味。因而，油麦菜采后清香风味迅速下降是急需解决的问题之一，探索油麦菜香气物质在贮藏过程中的变化规律、影响风味变化的关键香气成分具有重要意义。调研发现，目前市场上油麦菜采后贮藏主要有2种方式，一种是本地油麦菜当天采摘后在市场上直接常温摊贩售卖，另一种是外调油麦菜低温冷链贮藏销售。本研究模拟低温冷藏(4 ℃)和常温摊贩(24 ℃)两种销售模式，以油麦菜为研究对象，采用顶空-固相微萃取法提取油麦菜中的香气成分，并用GC-MS法测定油麦菜中挥发性香气成分，客观分析2种贮藏温度下0、3、6、9、12、24 h的生鲜油麦菜中挥发性香气成分的种类及绝对含量，探究油麦菜香气成分的变化，为油麦菜香气成分分析和油麦菜采后贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油麦菜，采自某科学院蔬菜基地。标准品的纯度及密度：正己醛(≥95.00%，0.82 g/mL)、反式-2-己烯-1-醛(≥97.00%，0.85 g/mL)、3-己烯-1-醇(≥97.50%，0.85 g/mL)、反式-2-己烯-1-醇(≥95.50%，0.85 g/mL)、正己醇(≥99.90%，0.81 g/mL)、苯甲醛(≥99.50%，1.04 g/mL)、正辛醛(≥98.00%，0.82 g/mL)、苯乙醛(≥90.00%，1.03 g/mL)、壬醛(≥94.50%，0.83 g/mL)、反，顺-2,6-壬二烯醛(≥94.00%，0.86 g/mL)、癸醛(≥95.00%，0.83 g/mL)、β-环柠檬酸(≥97.00%，0.94 g/mL)、β-紫罗兰酮(≥97.00%，0.95 g/mL)，美国Sigma-Aldrich公司；反,反-2,4-庚二烯醛(≥90.00%，0.88 g/mL)，东京化成工业株式会所;甲醇，色谱纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

7890a气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；固相微萃取手动进样器、57293-U聚二甲基硅烷/二乙烯苯萃取头(65μm PDMS/DVB)，美国Supelco(色谱科)公司；HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

参照RAMBLA方法[8]略有改动：4 ℃和24 ℃分别贮藏0、3、6、9、12、24 h的油麦菜样品去除根部后直接切成2 cm小段，真空包装后-21 ℃冷冻保存备用；在分析前，样品室温解冻后于搅拌机粉碎至均匀颗粒，取3 g样品与3 mL(4.23 g)饱和CaCl2混合后放入50 mL离心管，旋涡1 min后备用。

1.3.2 香气成分的提取[8]

准确称取2.00 g上述处理的油麦菜样品于20 mL顶空瓶中，迅速旋紧瓶盖平衡10 min，然后将萃取头插入顶空瓶，在50 ℃恒温水浴条件下萃取吸附10 min后，立即于GC-MS 250 ℃进样口解析1 min。

1.3.3 GC-MS条件

1.3.3.1 GC条件[8]

色谱柱：ZB-5石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；手动无分流进样，进样口温度260 ℃。程序升温：起始温度40 ℃，保持3 min；以3 ℃/min升温至60 ℃，保持0 min；以6 ℃/min升温至160 ℃，保持0 min；以30 ℃/min升温至250 ℃，保持3 min。检测器温度：250 ℃；载气He(99.9999%)，柱流速1.2 mL/min，压力恒定在0.134 MPa。

1.3.3.2 MS条件

电子(电离)EI源：电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；扫描模式全扫描；质量扫描范围m/z35～400。

1.3.4 定性与定量

定性：将各色谱峰对应的质谱图与标准谱库比对，并结合已知的标准品定性分析。依据正反相似度、匹配度及保留时间进行检索，选择正反匹配度均大于800的香气挥发物作为有效的香气成分，并通过油麦菜挥发性风味物质总离子流图与混合标样总离子流图比对定性相应化合物。

定量：香气成分鉴定由与已知的香气标准品比对进行定量测定[11]，采用外标法。具体方法如下：

储备液制备：香气标准品各取10 μL，用甲醇定容至10 mL，经稀释制得储备液后分别转移至顶空瓶4 ℃冷藏备用。标准曲线的绘制：各取10 μL一定浓度标准品储备液，用饱和CaCl2溶液定容至10 mL，制得各质量浓度约为1 μg/mL的混合标准溶液，将混合标准溶液用饱和CaCl2溶液进行逐级稀释，配制成一系列质量浓度约为0.02E-2、0.05 E-2、0.01 E-1、0.02 E-1、0.05 E-1、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 μg/mL的混合标准溶液，按照油麦菜香气的测定方法进行分析，根据各标准品的密度(g/mL)折算标准液中各标准品浓度，建立标准曲线。

OAV法：查阅文献香气物质的阈值，计算风味物质的OAV。OAV法按照公式(1)计算OAV[12]：

(1)

1.3.5 数据处理

油麦菜挥发物质采用NIST MS数据库进行谱库分析，数据采用SPSS 19.0进行处理。

2 结果与分析

2.1 香气成分组成

油麦菜香气成分及混合标准溶液(0.10 μg/mL)的总离子流色谱图如图1所示，鉴定结果如表1所示，共鉴定出14种香气成分。包括醛类9种、醇类3种、酮类1种、酸类1种。

图1 油麦菜香气物质的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 GC-MS total ion-current chromatogram of aroma compounds of Leaf-used lettuce

表1 油麦菜中香气成分含量和OAVTable 1 Contents and OAV of volatile components in leaf-used lettuce

注：MS表示利用GC-MS确定；S表示利用标准品鉴定；ND表示没有查到阈值的物质

2.1.1 醛类

油麦菜中种类最多的香气物质是醛类物质，占香气成分总量的57.54%，有正己醛(110.73 μg/kg)、青叶醛(251.01 μg/kg)、反,反-2,4-庚二烯醛(161.11 μg/kg)等，醛类物质是油麦菜中带有青草气的原因之一，但易发生氧化和聚合反应，导致其稳定性较差，容易使香气减弱变坏[20]。其中己醛具有脂肪香、清香、草香、蔬菜香和水果香气，可能是形成油麦菜青草香气的原因之一[21]；青叶醛呈绿叶清香、水果香气；反,反-2,4-庚二烯醛具有脂肪香和青香；苯乙醛具有浓郁的玉簪花香；壬醛具有油脂气味、甜橙气息、蜜蜡花香气息；葵醛具有新鲜油脂香、甜橙香、柠檬香、蜡香、并带有绿茶的爽快香气[22]。这些香气成分为油麦菜复杂的清香气味提供了积极贡献。脂肪酸的氧化降解可能是醛类产生的主要原因之一，另外，醛类化合物也可能源于油麦菜叶中的游离氨基酸发生Streck降解[23-24]。

2.1.2 醇类

醇类是油麦菜中含量第二的香气物质，占香气成分总量的42.26%，有叶醇(249.00 μg/kg)、正己醇(119.58 μg/kg)、反式-2-己烯-1-醇(38.14 μg/kg)。叶醇占总香气成分含量的25.87%，具有刚从草地割下的草和叶子的气味，天然存在于许多植物的叶子、精油和水果中，如茶叶、薄荷、大茉莉花、柚子、葡萄等；反式-2-己烯-1-醇具有苹果香气等果香气；正己醇具有玫瑰甜、淡木香。其中叶醇、反式-2-己烯-1-醇为萜烯醇类，具有典型的花果味[25-26]，研究发现其是形成茶叶香气的重要成分[27]。醇类物质主要由糖代谢、氨基酸脱羧和脱氢产生[28]，也可能是酵母菌和乳酸菌等油麦菜表面的微生物在发酵过程中的代谢产物。

2.1.3 酸类

油麦菜中仅检测出1种酸类物质为β-环柠檬酸，检出含量较低，仅占0.09%，主要呈现凉香、果香和清香[29]，与油麦菜主体香味基本一致。

2.1.4 酮类

油麦菜中酮类物质含量较低，占比仅为0.12%，虽然占比较低，对油麦菜的香气也具有一定的贡献，其形成可能与胡萝卜素类物质氧化降解或者不稳定化合物的氧化作用有关[29]，β-紫罗兰酮具有紫罗兰气息，花香浓郁，并带有果香味[30]。

2.2 主要香气成分的OAV分析

OAV是通过计算每一种香气成分的浓度与其阈值的比值来评估该物质对样品整体风味的贡献程度，当香气成分OAV大于1时，才认为其对香气有贡献作用[31-32]。由表1可知，共有10种挥发性成分OAV大于1，分别是正己醛、青叶醛、叶醇、反式-2-己烯-1-醇、正己醇、反，反-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、壬醛、反，顺-2,6-壬二烯醛、葵醛，主要为醛类和醇类物质。其中醛类物质主要赋予油麦菜以草香香气、清香味和果香，醇类主要赋予油麦菜以花香和果香。这些香味相互协调和融合，构成了油麦菜的特征香味。OAV大于100的香气成分包括青叶醛、叶醇、反式-2-己烯-1-醇、反，反-2,4庚二烯醛和反，顺-2,6-壬二烯醛，其中青叶醛、叶醇、反,反-2,4-庚二烯醛的OAV值大于3000，说明这3种物质是油麦菜挥发性成分中最主要的香气贡献化合物，主要赋予了油麦菜以清香、草香、蔬菜香和黄瓜香味[33]。

油麦菜香气成分中绝对含量高于20.00 μg/kg的有6种香气成分，包括正己醛、青叶醛、叶醇、正己醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛；OAV值大于100的香气成分有5种，包括青叶醛、叶醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醛。综合香气活性值(OAV)与绝对含量分析表明，油麦菜的主要特征香气成分共7种，分别是正己醛、青叶醛、叶醇、正己醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醛，这些香气成分可能是油麦菜特征的清香、草香和蔬菜香的主要来源。

2.3 两种贮藏条件下挥发性物质的变化

比较了4 ℃和24 ℃两种条件下贮藏0、3、6、9、12、24 h的油麦菜挥发性香气成分含量变化，结果如图2所示。

2种贮藏条件下油麦菜的主要香气成分种类没有发生变化，但香气成分的总量变化较大，如图2-O：4 ℃条件下油麦菜的香气成分总量显著减少(P<0.05)，由962.47 μg/kg下降到290.76 μg/kg，下降了69.79%；24 ℃条件下油麦菜的香气成分总量显著增加(P<0.05)，由962.47 μg/kg上升到1 726.77 μg/kg，上升了79.41%。

醛类挥发物是油麦菜中主要的香气成分，其中OAV大于1的醛类由高至低包括：反,反-2,4-庚二烯醛(3 288.04)、青叶醛(3 137.68)、反,顺-2,6-壬二烯醛(293.05)、正己醛(27.01)、苯乙醛(12.88)、壬醛(8.08)、葵醛(1.32)。4 ℃条件下，反,反-2,4-庚二烯醛、青叶醛、反,顺-2,6-壬二烯醛、正己醛和葵醛的含量在0～6 h逐渐下降，6～12 h有所回升，12～24 h又出现大幅度下降，壬醛的绝对含量在3 h内迅速下降后趋于稳定，苯乙醛的绝对含量小幅下降后又有所回升。整体而言，4 ℃低温贮藏24 h后，醛类物质含量由0 h时的550.68 μg/kg下降至184.77 μg/kg，下降了66.45%，正己醛、青叶醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醛、壬醛和葵醛含量显著降低(P<0.05)，苯乙醛含量有所增加。24 ℃条件下，大部分醛类挥发物含量出现先下降后上升的变化，而葵醛含量持续降低。整体而言，24 ℃常温贮藏24 h后，醛类物质含量由0 h时的550.68 μg/kg上升至739.82 μg/kg，上升了34.35%，正己醛、反,顺-2,6-壬二烯醛含量没有显著性变化，青叶醛、壬醛和葵醛含量有所降低，而苯乙醛和反,反-2,4-庚二烯醛含量显著性增加(P<0.05)。与4 ℃冷藏24 h后的油麦菜相比，常温贮藏的油麦菜 7种醛类物质24 h后含量均高于冷藏条件下的。醛类物质的大量上升一方面可能与抗坏血酸在热和氧的作用下降解产生大量的C6～C9小分子醛类和糠醛有关，另一方面可能是由高级醇氧化而来或氨基酸脱氨脱羧生成[34]。青叶醛和反,反-2,4-庚二烯醛的含量变化对油麦菜特征的绿叶清香和水果香气有重要影响。

图2 4 ℃和24 ℃贮藏条件下油麦菜贮藏0、3、6、9、12、24 h香气成分的含量Fig.2 The content of aroma components in leaf-used lettuce at the storage of 4 ℃and 24 ℃ for 0、3、6、9、12、24h respectively注：不同的小写字母表示在同一贮藏温度不同贮藏时间条件下样品之间有显著性差异(P<0.05)；*表示同一贮藏时间不同贮藏温度条件下样品之间有显著性差异(P<0.05)

油麦菜中的醇类挥发物都对其香气成分有重要影响，其OAV值均较大，叶醇(3 557.13)、反式-2-己烯-1-醇(164.39)、正己醇(47.83)是油麦菜中典型的醇类挥发物。4 ℃条件下，醇类物质绝对含量随着贮藏时间延长呈下降趋势，由406.72 μg/kg下降至103.57 μg/kg，下降了74.54%，其中叶醇、正己醇、反式-2-己烯-1-醇含量显著下降(P<0.05)。24 ℃条件下，醇类绝对含量随着贮藏时间的延长一直呈上升趋势，由406.72 μg/kg上升至978.83 μg/kg，上升了140.66%，其中叶醇、正己醇含量显著增加(P<0.05)。这可能是由于微生物发酵、氨基酸的脱氢脱羧及不饱和脂肪酸的生物酶作用转化，此外，脂肪热氧化和热降解的反应产物进一步热氧化分解也可形成醇类物质[35-37]。叶醇、正己醇是构成油麦菜芳香主体的来源之一，可赋予油麦菜以青草的气味和果香味[37]，其含量的变化可能会直接影响油麦菜的香气组成。

β-环柠檬酸和β-紫罗兰酮在4 ℃条件下和24 ℃条件下含量均下降，但2种香气成分的绝对含量较低，且不是油麦菜主要香气成分，所以对油麦菜的香气影响作用较小。

综上所述，青叶醛、反,反-2,4-庚二烯醛、叶醇、正己醇对油麦菜特征的青香味和果香味的变化有显著的影响。采后24 h内油麦菜在呼吸作用、蒸腾作用、微生物发酵等作用下其不同香气成分发生了复杂的反应，使其香气组成不断变化，进而引起了油麦菜清香味的变化。常温贮藏(24 ℃)有助于油麦菜主要挥发性香气物质的转化和合成，使其香气成分含量增加，加速其特征的蔬菜清香味释放，冷藏(4 ℃)减缓了油麦菜的呼吸作用和蒸腾作用，进而减缓油麦菜的清香味释放，有助于油麦菜的贮藏保鲜与调运。这也解释了消费者普遍反映的购买当地农户现摘的新鲜油麦菜比外地调运的油麦菜清香味更浓郁的现象。

3 结论

本试验利用HS-SPME-GC-MS对本地现摘油麦菜的香气成分进行了分析测定，并对采后油麦菜在4 ℃和24 ℃条件下分别贮藏0、3、6、9、12、24 h后香气成分变化进行了分析测定，结合OVA值和香气成分绝对含量分析，得出如下结论：

(1)油麦菜中共检测到有效挥发性香气成分14种，共四大类：醛类9种、醇类3种、酮类1种、酸类1种，香气成分以醛类和醇类化合物为主。

(2)查找阈值并计算，OAV大于100的香气成分包括青叶醛、叶醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛和反，顺-2,6-壬二烯醛，是构成油麦菜香气的主要贡献化合物。其中青叶醛、叶醇、反,反-2,4-庚二烯醛的OAV值大于3 000，说明这3种物质是油麦菜挥发性成分中最主要的香气贡献化合物，综合香气活性值与绝对含量分析表明，油麦菜的主要特征香气成分有7种，分别是正己醛、青叶醛、叶醇、正己醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛、顺-2,6-壬二烯醛，这些物质共同构成了油麦菜特征的清香、草香和蔬菜香。

(3)4 ℃和24 ℃贮藏条件下油麦菜的主要香气成分种类没有发生变化。4 ℃条件下油麦菜的香气成分总量显著下降(P<0.05)，24 ℃条件下油麦菜的香气成分总量显著上升(P<0.05)，香气成分的变化主要是由醛类挥发物和醇类挥发物含量变化引起的，其中青叶醛、反,反-2,4-庚二烯醛、叶醇、正己醇对油麦菜特征的清香和果香味的变化有显著的影响。4 ℃冷藏有助于减缓油麦菜香气成分的释放，对油麦菜贮藏保鲜有一定作用；24 ℃条件下有助于油麦菜香气的合成、积累和释放，所以当地农户现摘的油麦菜的清香味更加浓郁。因此，油麦菜适宜的贮藏温度有待于进一步深入研究。