红外光谱法测定奶粉中三聚氰胺和尿素

白静，王会

1(河南应用技术职业学院 化学工程学院，河南 郑州，450042)2(河南应用技术职业学院 护理学院，河南 郑州，450042)

三聚氰胺[C3N3(NH2)3],俗称密胺，蛋白精，含氮量高达66.6%，白色无味，在水中微溶，价格低，具有低毒性，不能作为添加剂加入到食品中。但是有些不法商贩作为“蛋白精”，加入饲料，奶制品，增加产品表现出的蛋白质含量，冒充蛋白质[1]。研究表明反复过量服用三聚氰胺会导致大头、肾结石等多种疾病，危害人体健康[2]。

尿素又名脲，其水溶液呈中性，是有机氮肥中的一种。在乳及乳制品中掺杂尿素，可以增加乳中的氮含量，进而提高蛋白质检测含量和增加密度。尿素含量测定在乳制品行业中具有十分重要的地位，其在乳及乳制品中的含量应低于0.70 mg/g[3]。而如果奶粉中的尿素含量超过正常范围，也会导致溃疡、癌症、消化不良、胃酸、肾功能疾病等健康问题[2]。

目前国内外在测定奶粉中三聚氰胺和尿素的含量有很多种，如荧光光谱法[4]、近红外成像技术[5]、红外光谱法[6]、拉曼光谱法[7]、气相色谱-质谱法[8]、高效液相色谱法[9]、利用非线性化学指纹图谱法[10]、同位素稀释质谱法[11]等。国标中规定测定奶粉中三聚氰胺和尿素的方法多采用滴定法和高效液相色谱法。

虽然这些方法测定奶粉中三聚氰胺和尿素的含量具有可行性，但是在其处理方面都有相应的缺陷。拉曼光谱法、非线性化学指纹图谱法、荧光光谱法检测速度快但易受干扰因素影响，成本较高且操作复杂；同位素稀释法虽然精密度高，检出限低，但是对操作要求过高，不能进行推广研究。

红外光谱法对样品检测无需进行复杂的预处理，建立模型后样品可在1 min内完成检测，对样品基本无损耗；分辨率高，但是对于光谱扫描得到的数据庞大，不易分析，因此常将红外光谱法结合化学计量学进行研究。

本文在研究红外光谱在奶粉掺三聚氰胺和尿素的应用中，结合二阶最小二乘法使用误差项不相关的工具变量来计算有问题的预测变量的估计值，然后通过计算值来估计因变量的线性回归模型。与常规的一元线性回归相比，该方法能对复杂关系分析其显著性并能去除异常点增加线性拟合程度[12]，对于奶粉中三聚氰胺和尿素的监控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与样品

雀巢全家营养奶粉市场购买；三聚氰胺(纯度≥99%)，购自天津市大茂化学试剂厂；尿素(纯度≥99%)，购自天津市大茂化学试剂厂；KBr(色谱纯，纯度≥99%)，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

尼高丽红外光谱仪Nicolet 380FT-IR，驭锘实业(上海)有限公司；分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；玛瑙研钵，湖南力辰仪器有限公司。

1.2 红外光谱测定参数

IR光源，波数4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1、扫描速度0.632 9 cm/s、扫描次数32次，扫描之前均需先采集空白背景，红外光谱仪预热30 min以消除外界环境的影响,提高光谱数据的有效信息量[13]。对光谱数据采用平均平滑法进行预处理，选用平滑窗口大小为15，在此条件下能很好地去除各种因素产生的高频噪声。样品数据光谱为3次扫描的平均值。每次压片测量都需要将ZnSe 晶体、压片螺母、玛瑙研钵等用无水乙醇洗干净、并置于日光灯下烤干，压片应该透过性好并无裂痕。

1.3 三聚氰胺标准品梯度制备

将称量瓶洗干净放入烘箱中烘干，用分析天平(精度0.000 1)称取不同质量分析纯的三聚氰胺和溴化钾，先将KBr置于研钵中研磨至粉末，再与三聚氰胺以逐步混匀法混匀，得到12个三聚氰胺标准品的梯度含量，置于称量瓶中标记，并按照1.2光谱条件测定。

1.4 尿素标准品梯度制备

先将称量瓶洗干净放入烘箱烘干，称取不同质量分析纯的尿素和KBr，分别将KBr和尿素置于研钵研磨，再将尿素和KBr按照逐步混匀法混匀，得到12个尿素标准样品的梯度含量，置于称量瓶中标记，并按照1.2光谱条件测定。

1.5 样品测定

称取不同质量的三聚氰胺和奶粉，按照逐步混匀法混合均匀，得到3个掺入三聚氰胺的奶粉伪样品三聚氰胺含量分别的为2.018 1、4.995 9、8.291 6 g/100g，置于称量瓶中标记，并按照1.2光谱条件测定。同时依据GB/T22388—2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法中规定的高效液相色谱法对三聚氰胺进行测定。

称取不同质量的尿素和奶粉，按照逐步混匀法混合均匀，得到3个掺入尿素的奶粉掺伪样品，尿素含量分别为1.574 4、4.409 2、6.452 4 g/100g，置于称量瓶中标记，并按照1.2光谱条件测定。同时依据GB/T 21704—2008乳与乳制品中非蛋白质含量测定中规定的滴定法对尿素进行测定。

2 结果与分析

2.1 三聚氰胺特征吸收峰确定

图1 三聚氰胺和奶粉红外光谱叠加图Fig.1 Melamine and milk powder infrared spectrum superposition

三聚氰胺和奶粉是物理混合，对样品混合的12组三聚氰胺标准品的光谱数据进行处理。

2.2 尿素特征吸收峰确定

图2 尿素和奶粉红外光谱叠加图Fig.2 Infrared spectrum superposition diagram of urea and milk powder

由于尿素和奶粉是物理混合，对样品混合的12组尿素标准品扫描后的红外光谱数据进行处理。

对比尿素和奶粉红外光谱叠加图可以看出,尿素在538、1 157、1 450、1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1处吸光度大，比较奶粉红外光谱图可知在1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1四个点处吸光度较弱，并且随着尿素含量的增大，吸光度在此4个点逐渐增大，符合朗伯比尔定律，因此对这4处吸收峰进行回归分析，进而进一步确定最佳特征吸收峰进行定量分析。

2.3 奶粉掺三聚氰胺模型建立及回归分析

三聚氰胺特征吸收峰为732、1 551 cm-1，按照1.2光谱条件进行的红外光谱分析数据如表1所示。根据表1对三聚氰胺在732、1 551 cm-1处吸光度进行定量分析，建立一元线性回归方程后发现在732 cm-1线性相关性为0.930 3，在1 551 cm-1线性相关性为0.993 3，因此选取1 551 cm-1为三聚氰胺特征吸收峰。

由表1可知，三聚氰胺的含量和1 551 cm-1吸光度呈现出一定的正相关关系，关系式如公式(1)所示：

Y=ax+b+c

(1)

式中：Y表示1 551 cm-1吸光度；x表示三聚氰胺的含量；c表示其他因素对吸光度的影响总和，比如KBr的质量、或者奶粉样品的品种、噪声对吸收峰的影响等，一般认为他们是相互独立且服从正态分布的随机变量。

表1 三聚氰胺特征吸收峰含量和吸光度Table 1 Characteristic absorption peak lontent and absorbance of melamine

通过SPSS软件读取表1中三聚氰胺含量(工具变量)，1 551 cm-1吸光度(因变量)，KBr质量(解释变量)进行二阶最小二乘分析同时绘制出三聚氰胺含量和1 551 cm-1吸光度的散点图(图3)，得到复相关系数为0.999 0，ANOVA(方差分析)表格中统计检定值F为11.456，sig(显著性)为0.007,说明三聚氰胺含量对吸光度影响显著(sig小于0.05说明回归效应显著，回归方程成立)，存在回归关系；系数表格中虽然KBr质量对应sig为0.007，但是对应统计检定值t(发生几率)为-3.385，说明溴化钾质量对三聚氰胺含量和吸光度无影响。

图3 三聚氰胺标准品原始数据散点图Fig.3 Scatter plot of original data of melamine standard

应用SPSS进行回归分析得到回归标准化预计值和回归标准化残差图如图4，由图4可以看出，大部分点残差在-2～+2，说明回归方程显著，但是S3点回归标准化残差值在+2～+3，标准化残差异常，因此应该去除S3进行建立线性模型，以三聚氰胺含量(g/100g)作为横坐标，以吸光度作为纵坐标进行回归分析绘制标准曲线(图5)得y=0.219 7x+0.700 4，R2=0.999 2，检出限为0.744 2～3.986 1 g/100g。

图4 三聚氰胺回归标准化残差图Fig.4 Melamine regression standardized residual plot

图5 三聚氰胺标准品线性拟合图Fig.5 Melamine standard linear fitting diagram

2.4 奶粉掺尿素模型建立及回归分析

对尿素在1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1四个特征吸收峰进行定量分析，按照1.2光谱条件进行的红外光谱分析数据如表2所示，建立回归方程后比较可得5个峰值线性相关度分别为0.872 1、0.909 2、0.774 9、0.856 7、0.856 5，因此选取1 655 cm-1作为奶粉掺加尿素的特征吸收峰进行定量分析。

表2 尿素特征吸收峰和吸光度Table 2 Characteristic absorption peak and absorbance of urea

由表2可知，三聚氰胺的含量和1 551 cm-1吸光度呈现出一定的正相关关系，关系式如公式(2)所示：

Y=ax+b+c

(2)

式中：Y表示1 551 cm-1吸光度；x表示三聚氰胺的含量；c表示其他因素对吸光度的影响总和，比如KBr的质量、或者奶粉样品的品种、噪声对吸收峰的影响等，一般认为他们是相互独立且服从正态分布的随机变量。

通过SPSS软件读取表1中尿素含量(解释变量)，1 655 cm-1吸光度(因变量)，KBr质量(工具变量)进行最小二乘分析同时绘制出尿素含量和1 655 cm-1吸光度的散点图(图6)，得到复相关系数为0.954，调整后相关系数为0.999 3，ANOVA表格中sig为0.168，统计检定值F为2.207，说明尿素含量和吸光度呈现线性正相关，表格中溴化钾质量对应sig为0.68，说明KBr质量对尿素含量无影响。

图6 尿素标准品原始数据散点图Fig.6 Scatterplot of raw data for urea reference

应用SPSS进行回归分析得到回归标准化预计值和回归标准化残差图如图7，由图7可知，大部分点残差在-2～+2，说明回归方程显著，但是N1点标准化残差值在+2～+3，因此去除N1进行线性拟合建模，以尿素含量(g/100g)为横坐标，以1 655 cm-1吸光度为纵坐标进行回归分析绘制标准曲线(图8)，为y=0.089 5x+0.390 8，R2=0.999 3，由于N1号样品吸光度异常，故检出限为0.042 5～1.729 0 g/100 g。

图7 尿素回归标准化残差图Fig.7 urea regression standardized residual plot

图8 尿素标准品线性拟合图Fig.8 A linear fitting diagram of urea standards

2.5 奶粉掺三聚氰胺精密度和准确度实验

取高效液相色谱法测定掺伪含量为2.018 1 mg/100g样品1份，按照1.2分析条件进行红外光谱测定，平行测定3次，再将三聚氰胺掺伪特征峰处吸光度代入各自回归分析方程中进行测定得出其掺伪含量计算绝对误差和相对标准，准确度用绝对误差表示，精密度用相对标准偏差表示[15]，计算结果如表3所示。

表3 三聚氰胺精密度实验结果Table 3 Precision test results of melamine

2.6 奶粉掺三聚氰胺结果计算及加标回收率

将1.4配制的奶粉掺伪三聚氰胺梯度样品S1、S2、S3，按照1.2光谱条件进行分析，并将1 551 cm-1吸收峰带入回归方程中计算掺伪含量并计算加标回收率，结果如表4所示。

表4 三聚氰胺加标回收率实验结果Table 4 Experimental results of melamine spiked recovery rate

2.7 奶粉掺三聚氰胺重现性实验

取含量为2.018 1 g/100g三聚氰胺，在间隔1、3、5天对3个样品按照1.2红外光谱条件进行测量，再将三聚氰胺掺伪1 551 cm-1处吸光度代入回归分析方程中进行测定得出其掺伪浓度计算精密度，结果如表5所示。

表5 三聚氰胺重现性实验结果Table 5 Reproducibility test results of melamine

2.8 奶粉掺尿素精密度和准确度实验

取滴定法法测定掺伪含量为1.574 4 g/100g样品1份，按照1.2分析条件进行红外光谱测定，平行测定3次，再将其特征峰处吸光度代入回归分析方程中进行测定得出其掺伪含量并计算准确度和精密度[16]，结果如表6所示。

表6 尿素精密度实验结果Table 6 Precision test results of urea

2.9 奶粉掺尿素结果计算及加标回收率

将配制的奶粉掺伪尿素梯度样品按照1.2光谱条件进行分析，并将1 655 cm-1吸收峰带入回归方程中计算掺伪浓度并计算加标回收率，结果如表7所示。

表7 尿素加标回收率实验结果Table 7 Experimental results of urea standard addition recovery rate

2.10 奶粉掺尿素重现性实验

取尿素含量为1.574 4 g/100g掺伪样品，在间隔1、3、5 d对样品按照1.2红外光谱条件进行测量，再将尿素掺伪1 655 cm-1处吸光度代入尿素回归分析方程中进行测定得出其掺伪浓度计算精密度，结果如表8所示。

表8 尿素重现性实验结果Table 8 Results of urea reproducibility experiment

3 结论

通过奶粉和三聚氰胺和尿素红外光谱图官能团分析，结合标准浓度梯度的三聚氰胺图谱确定特征吸收峰，通过SPSS软件回归分析和最小二乘法优化处理建立三聚氰胺的标准曲线，为y=0.219 7x+0.700 4，线性相关性为0.999 2，最低检出限为0.744 2 g/100g，精密度RSD=0.50%，重现性RSD=3.12%，回收率为100.21%。尿素的标准曲线为y=0.089 5x+0.390 8，线性相关性为0.999 3，最低检出限为0.042 5 g/100g，精密度RSD=1.56%，重现性RSD=3.51%，回收率为99.66%。结果表明，此方法与国标法相比可以很好的用于奶粉中三聚氰胺和尿素的定量分析，实现三聚氰胺和尿素快速无损检测。