中药药渣中固氮菌、解磷菌、解钾菌的筛选

王明欢，张小娜，林 冰，邓锦辉，张 英

（广州中医药大学，广东 广州 510000）

中药药渣来源于中成药生产、中药材加工与炮制、原料药生产等，以中成药生产带来的药渣量最大，约占总量的70%［1］，目前其处理方式主要是堆放、焚烧、填埋，不仅占用大量土地资源，严重污染土地及地下水，而且还造成资源浪费［2］。它富含有纤维、多糖、蛋白质、微量元素等营养成分，质轻、透气性好［3］，不失为一种优质的微生物堆肥原料。

国外大多以家禽粪便、污水污泥等为原料进行有机堆肥［4-5］，但目前大量抗生素、激素饲料应用于养殖业，其所含的重金属在动物体内囤积，并有一部分随粪便排出，以其为肥料时可造成土地及农作物污染。随着人们环保意识的增强，有机食品生产、资源再生利用与微生物肥料生产相结合已成为现代农业发展方向［6］。

我国腐植酸类肥料（有机肥）肥源分布广、贮量大、成本低，中药药渣便是其中一种，它经过高温提取后已基本腐烂，极易被微生物利用。微生物肥料中发挥作用最大的是固氮菌、解磷菌、解钾菌，其中固氮菌能固定空气中氮元素，从而供植物吸收；解磷菌、解钾菌可将植物无法吸收的难溶性磷、钾转化为可溶性的，故筛选出高效的3种菌是制备微生物肥料的关键。本实验将从中药药渣中进行相关筛选为今后叶类药渣制备生物有机肥料提供参考。

1 材料

1.1 仪器 VD-650 桌上式洁净工作台（苏州净化设备有限公司）；YXQ-SG46-280SA 手提式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；THZ-103B 恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；UV-2100 紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；AA7000 原子吸收分光光度计（日本岛津公司）；vario EL cube 元素分析仪（德国Elementar公司）；旋转蒸发仪（德国IKA 公司）；FD-1C-50 冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；CR22 冷冻离心机（日本Hitachi 公司）。

1.2 原料 广州中医药大学制药工程实验室外已堆放1 年的夏桑菊药渣，广州某中药厂室外堆放3 年的药渣。

1.3 试剂 琼脂粉（广东环凯微生物科技有限公司）；钾长石粉（广州翔博生物科技有限公司）；溴百里香酚蓝（天津市天新精细化工开发中心）；抗坏血酸、酒石酸锑氢钾、钼酸铵、硼酸、甲基红（上海麦克林生化科技有限公司）；溴甲酚绿（上海展云化工有限公司）；葡萄糖、蔗糖、H2SO4、K2HPO4、K2SO4、NaCl、CaCO3、MgSO4·7H2O、NaHPO4、FeCl3·6H2O、（NH4）2SO4、KCl、FeSO4· 7H2O、MnSO4· H2O、Ca3（PO4）2、H2O2、CuSO4、无水乙醇均为分析纯。采用钼蓝比色法测定发酵液中可溶性磷，试剂配制方法见文献［7］。

1.4 培养基

1.4.1 Ashby（阿须贝）无氮培养基 组成为KH2PO40.2 g、NaCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCO35.0 g、CaSO4·2H2O 0.1 g、甘露醇10 g、琼脂20 g（液体培养基则不加）、蒸馏水1 000 mL，调pH 至7.0，121 ℃下灭菌20 min。

1.4.2 蒙金娜固体培养基（无机磷固体培养基）组成为葡萄糖10 g、Ca3（PO4）225 g、（NH4）2SO40.5 g、MgSO4· 7H2O 0.3 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO40.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、琼脂20 g（液体培养基则不加）、蒸馏水1 000 mL，调pH 至7.0。

1.4.3 有机磷固体培养基 组成为葡萄糖10.0 g、（NH4）2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、琼脂20 g（液体培养基则不加）、蒸馏水1 000 mL，调pH 至7.0，灭菌后冷却至60 ℃左右，加入10 mL 蛋黄液（生理盐水与蛋黄液比例1∶1）。

1.4.4 解钾培养基 组成为Na2HPO42 g、FeCl30.005 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO30.1 g、蔗糖5 g，钾长石粉（去离子水洗涤5 次）1 g、溴百里香酚蓝0.1 g、琼脂20 g（液体培养基则不加）、蒸馏水1 000 mL，调pH 至7.0。

2 方法

2.1 固氮菌筛选

2.1.1 固氮菌分离 取10 g 药渣加入20 mL 无菌水中振荡5 min，逐级稀释至1×10-1、1×10-2，各取0.2 m L 涂布于Ashby 无氮固体培养基上，28 ℃下培养48 h，挑取能够生长的单一菌落，平板划线法进一步分离纯化，挑取单菌株转接至斜面，保藏培养基。

2.1.2 固氮能力测定 将“2.1.1”项筛选的固氮菌接种于Ashby 无氮固体培养基中，28 ℃恒温箱中培养3 d，活化。从平板上挑取菌种至200 mL 新鲜的无氮液体培养基中，28 ℃、180 r/min 振荡培 养3 d，得到种子液，6 000 r/min下离心10 min，除去上清液，沉淀，称定质量，取一定量沉淀干燥至呈均匀粉末状，称定质量，命名为中药菌体-1。剩余菌泥均分为3 份，接种至3 个300 mL 新鲜的Ashby 无氮液体培养基中，28 ℃、180 r/min 振荡培养7 d。将发酵7 d 后的液体培养基离心，上清液旋蒸后冷冻干燥得均匀粉末，称定质量，命名为中药发酵液-1，而沉淀在50 ℃干燥后称定质量，命名为中药菌体-2。然后，将上述所得3 份样品通过元素分析仪［8］进行分析，得到氮含有量。

2.2 解磷菌筛选

2.2.1 解磷菌分离 菌悬液按“2.1.1”项下方法制备，逐级稀释至1×10-2、1×10-4，各取0.2 mL 涂布于有机磷固体培养基上，30 ℃下培养48 h，挑取有明显溶磷圈的菌落，接种于蒙金娜固体培养基上，选取有溶磷圈的菌落作进一步划线分离，挑取单菌落，转接至菌种保藏培养基。

2.2.2 解磷能力测定 将“2.2.1”项下筛选的解磷菌接种到活化培养基平板上，从不同菌株平板上各挑取一环解磷菌至液体种子培养基，制备菌悬液。吸取每株菌的菌悬液各2 mL 至蒙金娜液体培养基中，以2 mL 无菌水加至液体培养基中作为对照，在恒温摇床内30 ℃、180 r/min 培养7 d，钼蓝比色法［8］测定发酵液中可溶性磷含有量。

2.3 解钾菌筛选

2.3.1 解钾菌分离 菌悬液按“2.1.1”项下方法制备，逐级稀释至1×10-1、1×10-2，各取0.2 mL 涂布于解钾培养基平板上，30 ℃下培养48 h。挑取溶钾圈与菌落直径比（D/d）较大的菌株，平板划线法将其接种到新鲜的解钾培养基上，观察溶钾圈情况再将单菌落转接至斜面保藏培养基。

2.3.2 解钾能力测定 将“2.3.1”项下筛选的解钾菌接种到活化培养基平板上，从不同菌株平板上各挑取一环解钾菌至液体种子培养基中，制成菌悬液。吸取每株菌的菌悬液各2 mL 至解钾培养基中，2 mL 无菌水加至液体培养基中作为对照，在恒温摇床内30 ℃、180 r/min 下培养7 d，原子吸收分光光度法［9］测定发酵液中可溶性钾含有量。

3 结果

3.1 固氮菌 经初筛、复筛后，得到1 株活力较高的固氮菌，为圆形，乳白色，半透明，边缘及表面光滑，稍凸，湿润粘稠状，命名为GD-1。然后，采用vario EL cube 元素分析仪测定固氮能力，结果见表1，可知在培养基没有加外源氮的情况下该菌株仍能生长，固定于空气中的氮一部分用于菌体自身生长，另一部分溶于发酵液。

表1 固氮能力测定结果（，n＝3）

表1 固氮能力测定结果（，n＝3）

3.2 解磷菌 筛选得到的①号为圆形，白色，奶油状，表面凸起，有绒毛，不透明，易刺破，命名为JP-1；②号为圆形，白色，褶皱，不透明，边缘整齐，命名为JP-2。然后，采用钼蓝比色法测定可溶性磷含有量，以其为横坐标（X），吸光度（700 nm 波长处）为纵坐标（A）进行回归，得方程为A=0.517 4X-0.001 8（R2=0.999 8）。解磷能力见表2，可知JP-2 解磷能力强于JP-1，但两者溶解磷酸钙能力均不强，故今后需继续筛选得到解磷效果更好的菌株以增加堆肥肥效。

表2 解磷能力测定结果（，n＝3）

表2 解磷能力测定结果（，n＝3）

3.3 解钾菌［10］筛选得到的①号为黄色，菌落较小，命名为JK-1；②号为黄色，圆形，菌落大，表面呈油滴状，命名为JK-2；③号为金黄色，菌落圆形，命名为JK-3。然后，采用原子吸收分光光度法测定可溶性钾含有量，以其为横坐标（X），吸光度（766.39 nm 波长处）为纵坐标（A）进行回归，得方程为A=0.308 68X+0.067 360（R2=0.999 2）。解钾能力见表3，可知JK-2 最强，其次是JK-3，JK-1 最弱，但后来在传代培养中发现三者解钾能力都有所减弱，可能因为取样较深，分离得到的微生物是兼性厌氧菌，在好氧环境中生长时难以发挥作用所致，具体原因还需进一步探讨。

表3 解钾能力测定结果（，n＝3）

表3 解钾能力测定结果（，n＝3）

4 讨论

本实验筛选得到固氮菌GD-1，通过元素分析仪测定其有效氮含有量为4.91 mg/L，具有较强的固氮能力；筛选得到2 株解磷菌JP-1、JP-2，通过钼蓝比色法测定其释放的有效磷含有量分别为2.68、4.60 mg/L，均有一定的解磷能力，而且后者更强，但与个别分离自其他环境中菌株解磷能力相比［11-12］，解无机磷能力较弱（最高为4.60 mg/L）；筛选得到3 株解钾菌JK-1、JK-2、JK-3，通过原子吸收分光光度法测定其可溶性钾含有量分别为0.80、0.92、0.90 mg/L，解钾能力依次为JK-2 强于JK-3 强于JK-1。另外，所得解磷菌、解钾菌随着传代次数增加解磷、解钾能力逐渐减弱，与大量文献报道一致［13］，原因尚不明确，需作进一步探索。

综上所述，本实验为从中药药渣中筛选高效固氮菌、解磷菌、解钾菌提供了一种思路，可为相关资源化利用奠定基础。但与从其他基质中筛选微生物相比还存在一定的差距，今后将通过大量筛选或结合基因工程的方法得到可用于产业化的堆肥菌剂。