Hsa＿circ＿USP42竞争性结合miR⁃182⁃5p抑制三阴性乳腺癌转移的机制研究

于金玲，高蓓敏，沈卫达，崔 静，王浩峰，朱江帆

（1.同济大学附属东方医院普外科，上海 200120；2.上海市长宁区妇幼保健院乳腺科，上海 200051）

目前，乳腺癌仍位居女性恶性癌肿发病首位［1］。三阴性乳腺癌（thriple⁃negative breast cancer，TNBC）是一种特殊类型的乳腺癌亚型，雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）及人表皮生长因子受体（human epi⁃dermal growth factor receptor 2，HER2）表达均阴性，缺乏治疗靶点，容易复发及内脏转移，5年生存率不足 30%［2］。除化疗外，尚缺乏其他有效治疗措施。因此，迫切需要寻求新的靶标治疗分子［3］。环状 RNAs（circRNAs）是一类特殊的非编码RNA，具有高度稳定性和组织特异性［4］。而微小RNA（miRNA）在真核细胞的基因表达、细胞发育分化等发挥重要的调控作用［5］。近期研究表明，circRNA 具有 miRNA 应答元件（microRNA response elements，MREs），通 过 与 靶 miRNA 结 合，作 为miRNAs 海绵体，发挥竞争性抑制剂作用，调控相关RNA 的表达［6］。研究发现，miR⁃182⁃5p 在 TNBC 中高表达可下调MTSS1 水平，促进TNBC 转移，并通过高通量测序发现，hsa＿circ＿USP42 在 TNBC 中差异下调表达；靶miRNA 预测软件分析发现，环状RNA hsa＿circ＿USP42 在 371～377 碱基具有 miR⁃182⁃5p 可能的结合位点［7］。本研究通过分析 hsa＿circ＿USP42对TNBC 细胞株体外增殖、凋亡的影响，初步探讨circ＿USP42 靶向结合 miR⁃182⁃5p 在 TNBC 中发挥的相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本研究获得上海长宁区妇幼保健院伦理委员会批准（批准号 CNFBLLQKW⁃2016003）。收集完整的TNBC 患者临床及病理资料，并收集石蜡包埋的癌及癌旁组织；纳入患者共30 例，为2010年1月至2015年12月期间在上海市长宁区妇幼保健院接受乳腺癌改良根治的患者。所有患者均获得知情同意。患者基线资料：年龄 30 ～70 岁，平均（48.67±9.65）岁；绝经18 例，未绝经者12 例；淋巴结阴性患者9 例，淋巴结阳性患者 21 例；肿瘤病理分期：Ⅰ期和Ⅱ期患者共24 例，Ⅲ期患者6 例。入选标准：术前未接受过放疗及化疗，全部标本经两位病理科副主任医师读片，组织病理学确诊浸润性导管癌。有同侧腋窝淋巴结转移1 枚以上或者肿瘤直径＞5 cm 者，术后给予放疗。排除标准：术前接受过放疗及新辅助化疗者；有远处转移患者；特殊病理类型乳腺癌。

1.2 材料与试剂

MDA⁃MB⁃231 细胞株购于中国上海中科院细胞库；DMEM 培养基购于 Gibco 公司（货号 16000⁃044）；LipofectAMINETM3000 购于 Invitrogen 公司（货号 L3000015）；CCK8 试剂购于同仁化工研究所；RNA 反转录试剂盒购于 TaKaRa 公司（货号9109）。

1.3 仪器与设备

CO2培养箱购于 Thermo 公司（货号 3111）；荧光定量 PCR 仪购自 ABI 公司（货号 ViiA7／7500）；RT⁃PCR 反应膜购自ABI（货号4311971）；电热恒温水槽购自精宏科技（货号DK⁃8D）；酶标仪购自TECAN 公司（M100 PRO）；倒置显微镜购于Olympus 公司（货号 IX73）。

1.4 载体构建和细胞转染

构建带有目的基因 hsa＿circ＿0007823 circRNA至 psiCHECK2 载体和 pLCDH⁃ciR 载体中。将提取的质粒 pUC57⁃hsa＿circ＿0007823 与载体 pLCDH⁃ciR分别通过EcoRI／BamHI 进行双酶切；转化到大肠杆菌，小量提取质粒，进行酶切鉴定，选取酶切正确的质粒进行测序，将测序正确的质粒进行大量提取。

1.5 细胞增殖及迁移实验

1.5.1 CCK8 实验 收集细胞，加入适量的新鲜完全培养液轻轻吹打细胞至均匀的细胞悬液，计数，按1×104／孔的细胞密度将细胞悬液铺于96 孔板中，四周用 100 μL PBS 填充。将铺好的 96 孔板放于37 ℃、5% CO2培养箱培养 24 h。实验分为 2 组，空载转染组和circRNA 过表达质粒转染组，每组6 复孔。将 96 板在 37 ℃、5%CO2培养箱孵育 48 h，孵育时间结束，每孔加入10 μL CCK8 溶液，将培养板在培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定450 nm 吸光度（A450），绘制细胞活力曲线。

1.5.2 细胞迁移实验 细胞转染质粒24 h 后，弃去6 孔板原有培养基，加胰酶消化细胞，收集细胞并计数，用0.1% BSA 培养基重悬，细胞密度为2×105／mL，取上述细胞悬液 200 μL 接种于 Transwell小室中，下室放置含2.5% FBS 的培养基，放置细胞培养箱，常规培养24 ～48 h 后取出，弃掉上清液，加入无菌PBS，洗2 次，室温下用4%多聚甲醛固定10 min，然后弃除4%多聚甲醛，无菌PBS 洗2次，室温下再用结晶紫染色20 min，用蒸馏水洗掉小室上多余的结晶紫，室温干燥，倒置显微镜观察细胞、计数并拍照。

1.5.3 细胞侵袭实验 将人工基质胶（20 μg）包被于8 μm 孔径的Transwell 侵袭小室聚碳酯微孔膜的上表面，置于37 ℃细胞培养箱中静止30 min，使其聚成凝胶。收集转染24 h 后的细胞，计数，用0.1% FBS 的培养液制备成 1×106／mL 细胞悬液，在Transwell 上室中加入200 μL 细胞悬液，下室中加入 600 μL 含 10% FBS 的培养液，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中静止培养48 h 后取出Transwell 小室，PBS 润洗，用棉签去除上室中的基质胶和细胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS 润洗后，结晶紫室温染色15 min，蒸馏水冲洗浸泡，显微镜下观察拍照。

1.6 双荧光素酶报告基因检测

将 circRNA hsa＿circ＿USP42 与 hsa⁃miR⁃182⁃5p的结合位点前后200 bp 序列克隆构建至报告基因载体psicheck2，同时合成上述预测到的miR⁃182⁃5p mimics。收集培养好的 293T 细胞，用无 PS 的完全培养液重悬细胞，按每孔4×104个细胞，接种至24孔板中，放置细胞培养箱中静置培养过夜。细胞换成无血清培养基 a（3 μL LipofectamineTM3000＋25 μL无血清OMEM 培养液，室温静置5min）和无血清OMEM 培养基 b（100 nmol miRNA⁃182⁃5p mi⁃mics／mimic NC ＋ 500 ng psicheck2 ／psicheck2⁃ciicRN A＋25 μL）室温静置 5 min。将上述中的 a 和 b 混合，室温静置20 min。加入制备的转染混合液于细胞中。去细胞上清液，加入裂解液充分裂解细胞后，12 000×g离心 5 min，取上清液。加入 100 μL 萤火虫萤光素酶检测试剂，混匀后测定RLU（relative light unit）。以报告基因细胞裂解液为空白对照。

1.7 Q⁃PCR检测hsa＿circ＿USP42过表达效果及靶miR⁃182基因的表达水平

（1） 收集培养好的 TNBC 细胞 MDA⁃MB⁃231，过表达hsa＿circ＿USP42。取处理好的细胞，用 TRIzol试剂（大连宝生物工程有限公司）提取总RNA。以DEPC H2O 为对照测定 RNA 纯度和定量，取 2 μL RNA 溶液，在酶标仪上测定样本的浓度和质量。

（2） 用 PrimeScriptTMRT Master 试剂盒（日本TaKaRa 公司）按照说明书对总RNA 进行提取并反转录为 cDNA。qRT⁃PCR 在 Bio⁃Rad CFX96 系统（Bio⁃Rad 公 司） 上 使 用 TB GreenTMPremix Ex TaqTM（TAKARA 公司）进行。GAPDH 用作定量circRNA 和 mRNA 的内部参考，U6 作为 miRNA 的内部参考。结果与计算：各样品的目标RNA 和内参分别进行 real⁃time PCR 反应。基因的相对表达数据采用2-ΔΔCt法进行分析。引物及序列见表1。

表1 各基因的引物及引物序列Tab.1 Primers sequences of each gene

1.8 Western印迹法检测蛋白表达水平

RIPA 裂解液裂解细胞，置于冰上放置30 min，4 ℃，12 000×g离心 10 min，取上清液。使用 BCA试剂盒（Thermo Fisher Scientific 公司）测定蛋白浓度。将蛋白液与loading buffer 混匀，放入100 ℃水浴6 min。离心，放置冰上，配制 SDS⁃PAGE 分离胶。将等量的蛋白加载到凝胶上，电泳后使用转膜仪将蛋白转移到PVDF 膜上，然后用5%脱脂牛奶在37 ℃封闭 2 h。P 孵育一抗，内参（1 ∶5 000），目的蛋白（均按1 ∶1 000稀释），4 ℃，过夜。孵育二抗（1 ∶5 000），37 ℃，2 h。化学发光显影（Millipore ECL 发光液），记录并拍照。

1.9 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0 软件作图。采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。定量资料用±s表示（符合正态分布）或者中位数与四分位数间距（不符合正态分布）的形式表示。组间均值比较使用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hsa＿circ＿USP42在TNBC癌组织中低表达

qPCR 结果显示，TNBC 癌组织中 circRNA USP42 相对定量（5.969±3.076）低于癌旁组织（20.284±5.444），差异有统计学意义（t＝-16.469，P＝0.000），见图1。circRNA USP42 在淋巴结阳性组表达（3.575±1.612）低于淋巴结阴性组（6.995±2.999），差异有统计学意义（t＝4.039，P＝0.003）。

2.2 hsa＿circ＿USP42过表达抑制TNBC细胞迁移和侵袭

过表达质粒 circRNA hsa＿circ＿USP42 的细胞迁移数量减少（P＝0.028），过表达质粒 circRNA hsa＿circ＿USP42 的细胞侵袭数量减少（P＜0.000 1），见图1。

图1 circ＿USP42 过表达对TNBC 细胞迁移及侵袭的影响Fig.1 Effects of circ＿USP42 expression on cell migration and invasion of TNBC cells

2.3 hsa＿circ＿USP42过表达抑制TNBC细胞活力

CCK⁃8 检测结果显示，过表达质粒circRNA hsa＿circ＿USP42 的细胞活力水平降低（P＝0.000 8），见图2。

2.4 circRNA结合的miRNA荧光素酶筛选验证

通过网络数据库，预测环状 RNA hsa＿circ＿USP42 在 371～377 片段有 hsa⁃miR⁃182⁃5p 靶结合点。荧光素酶报告基因实验发现，将质粒circRNA hsa＿circ＿USP42 与 miR⁃182⁃5p mimics 共转染至TNBC 细胞系 MDA⁃MB⁃231，荧光素酶活性降低，差异有统计学意义（P＜0.000 1）表明 circRNA circ＿USP42 与 miR⁃182⁃5p 为有效结合，见图3。

图2 hsa＿circ＿USP42 过表达对 TNBC 细胞株增殖的影响Fig.2 Effects of hsa＿circ＿USP42 expression on cell proliferation of TNBC cells

图3 荧光素酶报告基因实验结果Fig.3 The results of luciferase report assay

2.5 circRNA⁃miRNA⁃靶基因验证

在 MDA⁃MB⁃231 中过表达环状 RNA hsa＿circ＿USP42，qPCR 验证 miR⁃182 及 MTSS1 靶基因表达水平，Western 印迹法检测MTSS1 的蛋白表达水平。qPCR 结果表明，与对照组比较，过表达质粒circRNA hsa＿circ＿USP42 转染细胞后，circRNA hsa＿circ＿USP42 的表达水平升高（P＝0.002 2）；miR⁃182⁃5p 的表达水平降低（P＝0.036），MTSS1 的表达水平升高（P＝0.001 7），差异均有统计学意义，见图4。

Western 印迹法检测结果显示，过表达质粒circRNA hsa＿circ＿USP42 细胞的 MTSS1 蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＝0.035 4），见图5。

图4 hsa＿circ＿USP42 过表达后 miR⁃182⁃5p 及 MTSS1mRNA 水平变化Fig.4 The expression of miR⁃182⁃5p and MTSS1 mRNA in hsa＿circ＿USP42 overexpression cells

图5 hsa＿circ＿USP42 过表达后 MTSS1 蛋白水平变化及灰度分析Fig.5 The expression of MTSS1 protein and gray value in hsa＿circ＿USP42 overexpression cells

3 讨 论

TNBC 是一类具有高度异质性的乳腺癌，严重危害女性健康。15%～20%的乳腺癌患者为TNBC［8］。在过去的几十年中，乳腺癌治疗取得了显著进展，总体死亡率下降。然而，TNBC 病理组织学分级差，肿瘤侵袭性强，容易发生内脏转移。目前TNBC 治疗仍以化疗为主，尚缺乏内分泌及抗HER2 治疗靶点，3年后复发率可达 40%～50%［9］，预后仍然很差。因此，鉴定更多用于治疗TNBC 的抗癌分子靶标具有重要意义。

CircRNA 是一类以共价闭环为特征的非编码RNA，广泛存在于真核生物中，来源于基因的外显子或内含子，具有物种保守性及组织特异性。随着高通量测序技术和计算分析的发展，越来越多的circRNA 被发现，其在疾病发生中的调控作用也越来越被重视［10］。相比线性 RNA 分子，circRNA 具有封闭的环状结构，没有 5′⁃3′的极性和 polyA 尾巴，因此不容易被RNA 核酸外切酶或者RNaseR 降解，更稳定［11］。大多 circRNAs 来源于外显子，具有可以结合 miRNA 的 MREs。circRNAs 主要存在于细胞质中，其表达丰度较高，具有组织特异性，相对保守。circRNAs 的上述特性决定了它们在转录后的重要作用，可作为疾病诊断及治疗的潜在靶点。

CircRNA 可作为内源性竞争RNA（ceRNA）分子，可能通过影响靶miRNA 与下游靶mRNA 结合而发挥作用［12］。有研究证明，在不同物种中，circRNA 可以发挥miRNA 海绵体的作用，通过与miRNA 竞争性结合，作为ceRNA，调控靶mRNA 的表达［13⁃14］，在疾病调控中发挥重要作用，作为潜在的疾病预后因子及治疗靶点［15］。约 30%以上的circRNA 发挥 miRNA 的 ceRNA 作用，形成 circRNA⁃miRNA⁃mRNA 多维调控网络，调控基因的表达。Piwecka 等［16］验证了环状 RNA Cdr1as 大约有 1 500个核苷酸，可能发挥海绵作用吸附miRNA 的作用。

microRNA 是较短的 RNA 分子，通常结合到mRNA 的互补序列上，因而控制着细胞产生的特定蛋白数量，发挥抑癌或促癌作用［17⁃18］。研究探索了miR⁃182 对 TNBC 细胞行为的作用，表明 miR⁃182在TNBC 组织和细胞中上调，可促进TNBC 细胞的增殖和侵袭，并证明 miR⁃182 可能通过下调靶mRNA 表达促进 TNBC 细胞增殖和迁移［19⁃20］。本课题组前期进行了 TNBC circRNA 测序，建立了circRNA 差异表达谱，挑选出差异表达显著的circ＿USP42 作为进一步研究对象。靶miRNA 预测结果表明，miR⁃182⁃5p 是与 hsa⁃circ⁃USP42 结合力最强的5 个miRNA 之一。进一步通过数据库预测hsa＿circ＿USP42 在 371 ～377 及 412 ～419 两个碱基序列与 miR⁃182⁃5p 有潜在结合位点。荧光素酶报告基因质粒 circRNA hsa＿circ＿USP42 与 has⁃mir⁃182⁃5p共转染至细胞后荧光素酶活性显著降低，说明circRNA circ＿USP42 与 miR⁃182 有效结合。在本研究中，hsa＿circ＿USP42 在 TNBC 癌组织中的表达明显低于癌旁组织；在TNBC 淋巴结阳性组表达更低。在 TNBC 细胞株 MDA⁃MB⁃231 中过表达 hsa＿circ＿USP42，细胞的侵袭和迁移明显受到抑制，提示hsa＿circ＿USP42 可能发挥 miR⁃182⁃5p 的海绵调控作用，影响TNBC 的发生发展。荧光素酶报告基因实验证实 hsa＿circ＿USP42 与 miR⁃182⁃5p 有效结合；过表达 hsa＿circ＿USP42 后，靶 miRNA miR⁃182⁃5p显著下调，而靶基因MTSS1 在转录水平及蛋白水平均升高，提示 hsa＿circ＿USP42 可能发挥 miR⁃182⁃5p海绵作用，上调MTSS1 表达，抑制TNBC 侵袭及转移，在TNBC 发生发展过程中发挥抑癌作用；hsa＿circ＿USP42 与 miR⁃182⁃5p 的靶结合位点可能是TNBC 的潜在治疗靶点。

未来需要体内动物实验进一步阐明hsa＿circ＿USP42 作为 miR⁃182⁃5p 海绵调控体内机制。hsa＿circ＿USP42／miR⁃182⁃5p／MTSS1 轴对 TNBC 复发、转移的影响，有待进一步研究。