牛流行热病毒TaqMan实时定量PCR检测方法的建立及应用

汪祥斌，贾 坤，贾荣荣，李守军

(华南农业大学 兽医学院 广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室/广东省宠物工程技术研究中心，广东 广州 510642)

牛流行热(bovine ephemeral fever,BEF)是由牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus，BEFV)感染导致的急性传染病，主要由蚊子、库蠓等传播。牛是唯一的易感动物，病牛的特点是突然高热(双相热，常达到40℃以上)、肢体僵硬、皮下气肿、流涎、眼鼻分泌物增多、厌食、跛行等[1-2]。该病的特点是发病迅速，恢复也快(一般3 d可恢复)，发病严重时可导致牛死亡，目前对死亡的直接原因还知之甚少。由于感染后可导致牛产奶、耕作、生殖等能力的下降，给养牛业带来的损失相当巨大。目前，牛流行热主要发生于非洲、亚洲、澳大利亚的亚热带和温带地区，在中国南方和东南的很多区域都有发生和流行[3]。该病使奶牛产奶量降低，乳品质下降，牛跛行以及瘫痪，给养殖业造成了不可估量的经济损失。

牛流行热病毒是负义单链RNA病毒，呈典型的子弹状，病毒颗粒为75～185 nm，有些病毒颗粒呈现锥型，病毒的全长约为14 900 nt。其中已确定11组基因，顺序依次为3′-N-M1-M2-G-GNS-α1-α2-α3-β-γ-L-5′[4]。牛流行热G蛋白是牛流行热病毒中和抗体的靶蛋白，其与同科病毒具有结构的同源性。研究者用单克隆抗体发现4种G蛋白的表明抗原，分别称为G1～G4，目前只发现G1位点只和BEFV阳性血清产生特异性反应，其余都与同科病毒产生交叉反应[5-6]。到目前为止，国内外研究者已经建立多种BEFV抗体检测及快速检测方法[7-10]，TaqMan探针法实时定量PCR优点显著可快速、精确检测病毒，适合于病毒的快速分析检测。本试验在BEFV G基因的保守区设计探针和引物，建立了实时定量PCR检测方法，并运用该方法对临床收集的109份牛抗凝血样品进行检测。

1 材料与方法

1.1 病毒株及检测样品已鉴定患有牛流行热病毒牛抗凝血、蓝舌病病毒(BTV)、赤羽病病毒(ABV)及临床采集的109份牛抗凝血均由广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室提供。

1.2 主要试剂DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)、DH5α购自天根生化科技公司；RNA提取试剂盒购自宝日医生物技术有限公司；质粒小提试剂盒、Phanta®高保真酶购自南京诺唯赞公司；LightCycle®Probes Master购自聚研生物公司；pEASY®-Blunt Simple Cloning Kit试剂盒购自北京全式金公司。

1.3 引物和探针的设计从GenBank搜索BEFV G蛋白不同的基因序列并下载，运用MegAlign软件对序列分析，选取其保守区设计上、下游引物及探针，序列为：qPCR-1193-F:5′-TCATTGATAAGAATGAAGATGGC-3′,qPCR-1328-F:5′-TGGTTCCACAAAGATCATTC-3′,P:(FAM)5′-AGCTTCCTCCTGCTGGTGC-3′(BQ1),序列均由英潍捷基公司合成。

1.4 RNA的提取及反转录将牛抗凝血分离出白细胞层，按照RNA提取试剂盒里说明书的步骤操作得到总RNA，并将其反转录为cDNA。

1.5 标准品的制备对反转录的cDNA进行PCR扩增， PCR反应体系为：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，ddH2O 14 μL，cDNA 5 μL，总体积为50 μL。经过凝胶电泳后将产物回收并克隆于pEASY®-Blunt载体，构建重组质粒，命名为pEASY-BEFV，送华大基因进行测序鉴定。利用微量分光光度计得出质粒浓度，并换算为拷贝数。

1.6 反应条件的优化将pEASY-BEFV作为检测模板，控制单一变量，摸索探针和引物的最佳使用浓度。

1.7 敏感性试验及建立标准曲线10倍梯度稀释pEASY-BEFV，对不同浓度的质粒进行qPCR检测，对结果进行分析并绘制标准曲线及确定该方法能够检测的最低拷贝数。标准曲线的x轴为稀释倍数的对数，y轴为测出的Cp值。

1.8 重复性试验运用该方法，选取1010～104拷贝/μL的样品，在同一板和不同板上分别进行3次的重复试验，计算批内、批间重复的变异系数的平均值。

1.9 临床样品检测使用该方法对广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室收集的109份牛抗凝血进行检测。

2 结果

2.1 标准品的制备将cDNA按要求配好反应体系，通过PCR仪反应，经凝胶电泳后，结果在100～250 bp附近有明亮条带，符合预期结果(图1)。切下符合大小胶块，经试剂盒回收后与pEASY®-Blunt载体相连，并将质粒命名为pEASY-BEFV。经PCR检测及公司测序分析，其结果符合预期。扩大培养后提取质粒，使用微量分光光度计得到质粒质量浓度为226.9 mg/L，即拷贝数为1.33×1012拷贝/μL。使用双蒸水进行10倍梯度稀释，并储存于-20℃冰箱。

2.2 实时定量PCR方法的建立运用控制单一变量的方法对引物、探针进行优化，最终确定最优的反应条件，反应体系为： LightCycle®480 Probes Master(2×conc) 10 μL，10 μmol/L上游引物、下游引物各1 μL，0.5 μL探针，ddH2O 5.5 μL，模板2 μL，总体积20 μL。反应条件为：95℃ 5 min； 95℃ 20 s，53℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环，53℃收集荧光。

2.3 敏感性试验结果及建立标准曲线对已稀释好的pEASY-BEFV标准品进行检测，结果显示该标准曲线在1010～105拷贝/μL范围内线性关系较好(R2=0.998)(图2，3)。其可检测到101拷贝/μL，表明该方法较敏感。

图1 目的基因扩增 1．目的基因;M.DL2000 DNA Marker

图2 BEFV实时定量PCR的扩增动力学曲线

图3 BEFV实时定量PCR的标准曲线

2.4 特异性试验结果采用RNA提取试剂盒提取的蓝舌病病毒、赤羽病病毒RNA并反转录为cDNA，以pEASY-BEFV为阳性对照，测试该方法的特异性。结果显示，除质粒外，其余样品检测都为阴性，表明该方法特异性良好(图4)。

2.5 重复性试验结果用最优方法对选取的样品进行3次批内和3次批间重复qPCR试验，得到2种试验变异系数都较低(<3%)，说明重复和稳定性较好(表1)。

图4 BEFV实时定量PCR特异性检测结果 1.pEASY-BEFV;2.BTV;3.ATV;4.阴性对照

2.6 临床样品检测使用优化好的反应条件，对实验室收集的109份牛抗凝全血检测。其中检出8份阳性样品，阳性率为7%，表明可用于临床的初步检测。

表1 BEFV实时定量PCR重复性试验结果

3 讨论

随着牛场对本病重视程度的提高，本病零星散发或呈地方流行发生是近期我国的流行方式[11-12]，在中国南方，由于气候原因，本病可从春季开始散发，一直可持续到冬季，乳品质下降和死淘率上升等问题给养牛业造成了巨大的经济损失。疫苗目前仍然是最为有效的保护措施[13]，本病可通过阻断性治疗来治愈，有研究表明，运用RNA干扰技术可以有效抑制牛流行热病毒的增值[14]。发病时可用抗炎药物治疗疾病发展过程中的炎症，早期治疗效果更好[15]。所以，对于BEFV的早期检测显得尤为重要。

TaqMan实时定量PCR的优点众多，该方法快速便捷，检测结果精确，已被很多研究者运用于临床检测。本试验根据GenBank数据库上不同BEFV的 G基因序列进行比对分析，在保守区设计1对引物和探针，建立检测BEFV 的TaqMan实时定量PCR方法。该重复性试验得到的平均变异系数结果较好(<3%)；检测下限达到1×101拷贝/μL。运用该方法建立的标准曲线有良好的线性关系，相关系数可达0.998,。该方法与牛蓝舌病毒、牛赤羽病毒无交叉反应，能特异检测BEFV并具有较好的稳定性和重复性。通过对实验室收集的109份牛抗凝血样品进行检测，结果显示阳性率为7%，表明本方法可用于BEFV的临床检测，为有效防控BEFV提供技术支撑。