牛HSL基因shRNA干扰载体的构建及筛选

靳子康，房希碧，高 振，潘子意，刘 娟，姜 平，杨润军，赵志辉*

(1.广东海洋大学 农学院，广东 湛江524088；2．吉林大学 动物科学学院，吉林 长春130062)

激素敏感型脂肪酶(HSL/LIPE)是一种会对激素产生敏感的脂肪酶，其主要在脂肪组织中表达，并且其活性受激素调控，所以被称为激素敏感性脂肪酶。HSL基因与脂肪的分解与沉积密切相关，且被认为是骨骼肌甘油三酯水解的主要酶[1]。在牛的基因组中，HSL位于第18号染色体上，含有14个外显子和13个内含子，但其在家鼠和人上拥有15个外显子和14个内含子。据报道，HSL在动物体内出现了2种形式，一种是有活性的，另一种是无活性的。其中有活性的HSL能将TAG催化并水解为甘油二脂和游离脂肪酸[2]。并且通过研究表明HSL有两种途径可以被激活，一种是磷酸化的脂滴包被蛋白A(perilipin A)，这种包被蛋白能将其转移到脂滴表面，使脂滴表面产生水解。另一种是被cAMP依赖蛋白激酶(PKA)激活，是唯一能够通过磷酸化来控制其活性的酶，但后一种途径不能使HSL完全激活，其途径效率被检验表明是远远低于脂滴包被蛋白A的调节途径[2]。

HSL基因所编码的激素敏感性脂肪酶有着多功能的水解作用，主要水解脂肪组织中的甘油三酯，另外还能将卵巢、肾上腺、睾丸和胎盘中的胆固醇酯水解，在机体能量供应和类固醇生成作用中发挥重要作用[3]。其在脂肪组织中高表达，肾上腺、卵巢、睾丸、心脏、骨骼肌、巨噬细胞和胰岛细胞表达量较低[4]。据报道，在小鼠的HSL基因中编码有786个氨基酸，但没有跨膜多肽，推测HSL是一种不附着在膜上的自由蛋白。还有称在人类上，对体质量较高男女的HSL基因中的SNP位点分析中，表明此基因与血浆内的脂质和葡萄糖的含量有相关性[5]。此外，HSL对肉品质有的影响也有报道，并且通过对HSL的SNP位点相关性分析出，其与肉品质性状例如净肉率，脂肪酸含量，调味百分比和pH值等有相关性[6-7]。以及有报道称不饱和脂肪酸(SFAs)随着时间和浓度的延伸，牛乳腺上皮细胞(MEC)的HSL的mRNA表达水平也会随之上调[8]，表明脂肪酸的含量也可能会影响HSL基因的表达水平。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是通过用19～23 bp的小的双链RNA与目的片段结合从而使mRNA产生降解，能够有特异性地、高效地阻断目的基因的表达，使被干扰的基因无法翻译成蛋白质，从而产生细胞或个体有特定基因缺失的表型，是一种典型的转录后对基因调控的方式，又被称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。shRNA是一种长度为50～70个核苷酸的单链小分子RNA，具有特殊的茎环结构。其结构特点是：由5～10个核苷酸环与2条19～29个核苷酸的互补长链RNA片段连接，2条片段通过碱基互补配对成为双链茎干[9]。载体启动子的选择对于shRNA的高表达有着至关重要的作用，通过酶切和连接载体把设计好的shRNA片段导入细胞或早期胚胎中，使shRNA上设计的发卡结构能在细胞内被切割成小片段RNA，形成siRNA，随着siRNA结合到RNA所诱导的沉默复合物上(RISC)，此复合物能结合到目的基因的mRNA上，并通过片段的缺失导致mRNA的降解[10]。这种装载了shRNA的载体可通过稳定转染等途径被传递到子代细胞中去，使得基因的沉默可遗传，为研究特定基因的功能及调控方式创造了条件。目前，在人和小鼠等物种中存在大量关于HSL基因的研究，但对于牛HSL基因shRNA的靶序列筛选和载体构建的研究尚无报道。因此，为进一步探讨和深入研究牛HSL基因功能，本试验以牛HSL基因为研究对象，设计、构建和筛选了基因的shRNA干扰载体，旨在为牛HSL基因系统和深入的研究提供有效工具和试验材料。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及细胞系pGPU6-GFP-Neo载体由上海吉玛公司购买，pBI-CMV3过表达载体(Clontech)，pMD18-T Simple vector(TaKaRa)，感受态细胞(Trans GenBiotech)，牛胎儿成纤维细胞由本实验室分离培养，293T细胞系、pBI-CMV3-HSL过表达载体[11]由本试验保藏。

1.2 主要试剂质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、反转录试剂盒购自北京天根公司，Prime STAR HS DNA Polymerasa、DL2000 DNA Marker、SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)、T4DNA连接酶由TaKaRa公司提供，限制性内切酶(NEB)，Fugene HD转染试剂(Promega)，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清，DMEM/F12(1∶1)培养基购自Hyclone公司，Trizol试剂是Invitrogen公司产品，蛋白裂解液(博士德)。

1.3 shRNA干扰载体设计和构建牛HSL基因的CDS区序列从GenBank中获得，通过shRNA靶序列设计网站Invitrogen，筛选了4条靶序列，加入9 nt的TTCAAGAGA序列形成了1种含茎环的发夹结构，并且以6个T作为RNA polⅢ的转录终止子。分别命名为shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731、shRNA-HSL-1229、shRNA-HSL-2281，shRNA NC由上海吉玛公司合成，靶序列和DNA Oligo序列详情见表1。水浴退火，10 μL退火体系，正义链、反义链各1 μL，退火缓冲液(TE Buffer)1 μL，ddH2O 7 μL，混匀，放入95℃的水浴锅，水浴5 min，关闭水浴锅，待水温降至室温[12]。载体pGU6/GFP/Neo采用限制性内切酶进行酶切，50 μL体系，BamHⅠ，BbsⅠ 各1 μL，Cutsmart缓冲液5 μL，pGU6/GFP/Neo载体质粒20 μL，ddH2O 23 μL，37℃孵育酶切2 h，得到含有黏性末端的载体，用T4DNA连接酶将线性化载体与退火得到的DNA双链进行连接，退火产物2 μL系，T4DNA Ligase Buffer 2 μL，pGU6/GFP/Neo 2 μg，T4DNA Ligase 1 μL，ddH2O 13 μL，共20 μL，充分混匀，置于16℃金属浴中，过夜连接。连接后的质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑菌，筛选阳性克隆，提取质粒。采用BamHⅠ酶切鉴定，确定载体片段大小正确后，送至北京金唯智生物公司进行测序。对测序正确的菌种扩大培养，提取质粒，-20℃保存，备用。

表1 HSL基因shRNA载体靶序列和退火DNA Oligo序列

1.4 细胞培养与转染分别将保存在液氮里的牛成纤维细胞和293T细胞复苏并培养，培养至汇合度为80%以上时对其进行传代，铺六孔板，准备转染。加入不含抗性的10%血清的培养基，之后以1∶2.5的比例加入质粒与转染试剂，即质粒3 μg，Fugene转染试剂7.5 μL。全部加入后室温孵育15 min，随后添加到六孔板中，轻微晃动铺匀，放入培养箱培养。

1.5 细胞总RNA提取及鉴定转染48 h后收集细胞，采用Trizol方法提取细胞总RNA，将含有细胞的离心管中加入1 mL Trizol试剂，室温裂解5 min。加入200 μL氯仿，颠倒混匀，室温放置10 min，4℃、12 000×g离心15 min。将上清液移至新的无RNase的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，室温静置10 min，4℃、12 000×g离心10 min，弃上清。加入1 mL 75%的冷乙醇洗涤沉淀，混匀后4℃、7 500×g离心5 min弃上清。打开离心管盖，室温干燥RNA至半透明状，加入20 μL DEPC水溶解。采用Nanodrop2000检测RNA浓度，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有DNA和蛋白质污染，是否降解。利用反转录试剂盒，将1 μg 的总RNA反转录为cDNA，反转录后剩余总RNA -80℃保存备用。。

1.6 荧光定量检测转染48 h后，采用荧光定量PCR技术检测目的基因mRNA在细胞中的表达水平。荧光定量PCR反应体系：SYBR®Premix Ex Taq(2×)5.0 μL，PCR上游和下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，无核酸酶水3.6 μL，总反应体积10.0 μL；反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环；在定量扩增参数后增设溶解曲线程序：95℃ 15 s，60℃ 20 s，95℃ 15 s。以β-actin基因为内参(上游5′-CATCGGCAATGAGCGGTTC-3′；下游5′-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3′)，通过实时荧光定量检测的HSL基因mRNA表达水平(上游5′-GATGAGAGGGTAATTGCCG-3′；下游5′- GGATGGCAGGTGTGAACT-3′)。

1.7 细胞蛋白提取及检测转染pBI-CMV3-HSL和shRNA载体的293T细胞48 h后，6孔板中每个孔细胞加入200 μL蛋白裂解液，提取细胞总蛋白质。BCA试剂盒检测浓度后，调节上样量每孔加入30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳。分别以恒压80 V 和100 V电泳至浓缩胶和分离胶底部，并以200 mA恒流、50 min转至硝酸纤维素膜上。用5%的脱脂奶粉封闭2 h，按照1∶1 000浓度加入一抗HSL和Actin(内参)，4℃放置摇床上过夜孵育抗体。按1∶2 000浓度加入二抗羊抗兔IGg，室温摇床上孵育抗体1 h。调配显色剂使其显色，仪器曝光并拍照，对比样品和内参的灰度值。

2 结果

2.1 牛HSL基因shRNA载体的构建shRNA载体BamHⅠ单酶切结果显示，片段长度与预期结果一致(图1)。通过Sanger测序进一步表明，获得的shRNA干扰载体的序列与设计的shRNA干扰载体一致(图2)。以上结果表明成功构建牛HSL基因shRNA载体。

图1 牛HSL基因shRNA载体酶切鉴定结果 M.Lambda DNA/Eco130I Marker;1，2.HSL-Bos-731 BamHⅠ酶切结果；3，4.HSL-Bos-1229 BamHⅠ酶切结果；5，6.HSL-Bos-2281 BamHⅠ酶切结果；7，8.HSL-Bos-625 BamHⅠ酶切结果

2.2 BFF细胞中HSL基因干扰载体的筛选通过转染BFF细胞，在mRNA水平筛选具有较高干扰效率的干扰载体，显微镜下观察结果显示，细胞转染后48 h后，细胞形态正常，绿色荧光蛋白表达水平如图3所示。荧光定量检测结果表明，在mRNA水平，shRNA-HSL-625的干扰效率为14%、shRNA-HSL-731的干扰效率为83%、shRNA-HSL-1229的干扰效率为48%和shRNA-HSL-2281的干扰效率为41%，其中shRNA-HSL-1229和shRNA-HSL-2281组的细胞中HSL的mRNA表达水平与对照组shRNA-NC存在显著差异(P<0.05)，shRNA-HSL-731与对照组shRNA-NC存在极显著差异(P<0.01)，而shRNA-HSL-625与对照组shRNA-NC相比无显著差异(P>0.05)，因此，在BFF细胞中，shRNA-HSL-731具有较高的干扰效率(图4)。

图2 牛HSL基因shRNA载体测序峰图 A.HSL-Bos-731 shRNA载体；B.HSL-Bos-1229 shRNA载体；C.HSL-Bos-2281 shRNA载体；D.HSL-Bos-625 shRNA载体

图3 牛HSL基因shRNA载体转染BFF细胞 A～E.白光下细胞形态；a～e.激发光下绿色荧光蛋白

2.3HSL基因shRNA干扰载体效率验证由于BFF细胞HSL基因表达水平较低，不能检测到蛋白的表达水平，因此，采用过表达载体与干扰载体共转染293T细胞，进一步验证shRNA干扰载体和过表达载体在蛋白水平上HSL的表达情况。293T共转染24 h后，细胞形态良好，同时绿色荧光蛋白表达表明转染效率较高，为70%～80%(图5)。在mRNA水平shRNA-HSL-625的干扰效率为83%、shRNA-HSL-731的干扰效率为82%、shRNA-HSL-1229的干扰效率为78%和shRNA-HSL-2281的干扰效率为14%，其中shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731和shRNA-HSL-1229与对照组shRNA-NC存在极显著差异(P<0.01)，而shRNA-HSL-2281与对照组shRNA-NC相比无显著差异(P>0.05)，shRNA-HSL-731和shRNA-HSL-625具有较高的干扰效率(图6)。

图4 BFF细胞中HSL基因mRNA表达水平 1.*表示显著性差异(P<0.05)；2.**表示极显著性差异(P<0.01)。下同

在293T细胞中，对空白组和共转染组细胞中HSL基因蛋白水平质含量检测结果显示，未转染HSL过表达载体的293T细胞中牛HSL不表达，而过表达pBI-CMV3-HSL载体后，细胞中能够检测到HSL蛋白。在共转染干扰载体后，shRNA-HSL-2281的干扰效率最低，shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731和shRNA-HSL-1229共转染组中的HSL蛋白均未检测到，表明干扰效率较高，与mRNA表达水平一致(图7)。

图6 293T细胞中牛HSL基因mRNA表达水平 ***代表极显著差异,P<0.001

3 讨论

脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。其中，HSL就是一种激素敏感型脂肪酶，其活力受激素调控，在脂肪中高表达且主要由脂肪组织进行分泌，同时也在胰腺、睾丸、肌肉、肾上腺等组织发现其表达[4]。HSL作为一种细胞内的中性脂肪酶，能水解甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和胆甾烯基酯，没有水解磷脂酶活性。HSL基因敲除后导致脂肪水解能力被破坏，脂质合成和脂肪代谢能力明显下降，这说明了HSL在脂肪的合成及分解代谢中起着关键作用。机体运动起始时，HSL活化参与脂肪水解，这同时也是运动引起脂肪水解增加的主要原因。

图7 293T细胞中HSL基因蛋白表达水平(上为柱状图，下为印迹图) 1.未转染;2.shRNA NC;3.shRNA HSL-2281;4.shRNA HSL-1229;5.shRNA HSL-731;6.shRNA HSL-625

利用shRNA 表达载体进行RNAi技术在多种动物体内取得成功(如小鼠、大鼠)，利用shRNA干扰技术建立小鼠模型已有大量的报道，并且通过构建shRNA干扰载体验证多种基因对牛、羊早期胚胎、乳脂、肉质等有经济效益性状的影响，其中对牛早期胚胎发育的囊胚阶段发现有一定的影响[13]，临床上对牛病毒性腹泻也有相关的研究[14]。因shRNA能够特异的干扰目的基因的表达，并能持久稳定的作用于靶基因，使得该技术成为目前基因功能研究和生物治疗等领域的重要技术，有报道称shRNA干扰已经应用于家族性结肠息肉的临床治疗以及其他癌症的相关治疗，对改善胰岛素抵抗和脂肪肝也有最新的进展[15]。

本试验成功构建了shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731、shRNA-HSL-1229、shRNA-HSL-2281等4个干扰载体，转染BFF细胞初步检测了细胞中各载体在mRNA水平的干扰效率。但是,HSL基因在BFF细胞中表达量很低，通过Western blot未能检测到蛋白质含量。为进一步检测细胞内蛋白质水平的干扰效率，采用具有更高的转染效率且不表达牛HSL的293T细胞，通过过表达载体和shRNA载体共转染293T细胞后，进一步在mRNA和蛋白质水平验证了shRNA载体的干扰效率，结果显示shRNA-HSL-625、shRNA-HSL-731、shRNA-HSL-1229等3个干扰载体在mRNA水平和蛋白水平均显示干扰效率十分显著。因此，结合BFF细胞检测结果，最终确定shRNA-HSL-731作为干扰效率较高且比较稳定的载体用于今后的试验和研究更为合理。本试验研究结果为进一步研究HSL基因功能提供了有效工具，为牛脂肪代谢和HSL基因的作用机制研究奠定基础。