雷帕霉素靶蛋白复合物1对肠道3型固有淋巴细胞功能的影响

刘健悦 ，沈 蕾

1.上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系，上海200025；2.上海市免疫学研究所，上海200025

3型固有淋巴细胞（group 3 innate lymphoid cell，ILC3）是近年来新发现的一类重要的免疫细胞亚群，主要富集在肠道黏膜组织，表达转录因子视黄酸受体相关的孤儿核受体（retinoic acid receptor related orphan receptor，RORγt），并分泌细胞因子白细胞介素22（interleukin-22，IL-22）和IL-17[1-3]。ILC3表面缺乏抗原特异性受体的表达，在肠道中主要受细胞因子IL-23/IL-1β调控激活，在维持黏膜屏障完整性和抗病原体感染过程中发挥着重要作用[4-5]。研究[6]表明，ILC3功能缺失或低下可导致肠道细菌感染。在小鼠中，ILC3可基于细胞表面标志物趋化因子受体6（C-C motif chemokine receptor 6，CCR6）和天然细胞毒性受体（natural cytotoxicity triggering receptor，NCR，又称NKp46）的差异表达划分为不同亚群[7]。其中，CCR6+NKp46-ILC3是肠道淋巴组织发育所需的，可分泌IL-22和IL-17A；而共表达RORγt和T-bet（T-box transcription factor 21）的CCR6-NKp46+ILC3和CCR6-NKp46-ILC3主要分泌IL-22[8-9]。IL-22对于组织修复和宿主肠道组织抗细菌感染至关重要。一方面，IL-22信号可促进上皮细胞增殖、细胞间紧密连接的形成以及伤口愈合；另一方面，IL-22还调控与抗菌肽形成有关的基因表达以及上皮细胞的岩藻糖基化[10-13]。近年来，对ILC3发育和功能的研究越来越多，揭示了其在机体免疫中的重要性；但作为新兴领域，仍有许多问题需要解决，关于ILC3稳态及功能调节的相关研究仍具有重要意义。

雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，mTOR）是一种进化上高度保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）相关激酶家族，主要以2种复合体mTORC1（mTOR complex 1）和mTORC2的形式存在[14-15]。其中，关于mTORC1活化和功能的研究更为广泛和透彻，其可整合生长因子、压力、能量状态及氧气等多种胞内外信号，调控细胞生长、增殖、分化和自噬等过程。mTORC1主要由Raptor（regulatory associated protein of mTOR）、mLST8（mTOR associated protein）、PRAS40（proline-rich Akt substrate 40 kDa）、DEPTOR（DEP domain containing mTOR interacting protein）以及mTOR分子组成，对雷帕霉素反应敏感[16-18]。越来越多的研究表明mTORC1对免疫细胞的发育和功能起着重要的调控作用。mTORC1可以通过影响转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription）家族成员从而决定CD4+T细胞的谱系分化，如Yang等[19]发现mTORC1的重要组分Raptor缺失后会导致Th2和Th17细胞分化受损，但不影响Th1细胞的分化。mTORC1还可通过作用于缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF1）和干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）促进CD8+效应T细胞的分化和功能[20]。在B细胞中，有研究[21]发现mTORC1功能被抑制后，B细胞增殖和浆细胞分化减弱，体液免疫应答受损。此外，mTORC1还参与调节IL-23诱导的中性粒细胞中IL-22和IL-17的产生[22]。然而目前为止，关于mTORC1对固有淋巴细胞调控的研究仍很少。鉴于固有淋巴细胞与T细胞之间的相似性，我们推测mTORC1在ILC3的发育维持和功能调控中也起着重要作用。

本研究先通过体外的雷帕霉素（rapamycin）抑制实验探究mTORC1对ILC3功能的调控作用，然后构建ILC3特异性mTORC1功能缺失的条件性敲除小鼠，检测该小鼠肠道ILC3发育及功能的变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 本研究中所有小鼠均为C57BL/6背景，Rptorflox/floxRorcCre（Rptor为编码Raptor蛋白的基因，Rorc为编码RORγt蛋白的基因）小鼠由Rptorflox/flox小鼠和Rorccre转基因小鼠杂交获得，其中Rptorflox/flox小鼠受赠于中国人民解放军第三军医大学叶丽林教授课题组，Rorc-cre转基因小鼠受赠于中国科学院上海营养与健康研究所邱菊教授实验室。野生型C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。所有实验小鼠均饲养于上海交通大学医学院医学实验动物科学部的SPF级设施中，实验动物使用许可证为SYXK（沪）2018-0027。除非本文另有说明，否则实验用小鼠均为同窝6～8周龄雌鼠。所有动物实验均经上海交通大学医学院动物保护委员会批准。

1.1.2 主要试剂与仪器抗CD3、CD45R（B220）、CD11b、CD11c、Ly-6G（lymphocyte antigen 6 complex，locus G）、CD45.2和IL-22的抗体均购自BioLegend公司（美国），抗RORγt、NK1.1（CD161）和CD90.2抗体购自eBioscience公司（美国），抗杀伤细胞凝集素样受体G1（killer cell lectin like receptor G1，KLRG1）抗体购自BD Biosciences公司（美国），蛋白转运抑制剂Brefeldin A和细胞破膜固定液购自Thermo Fisher公司（美国），DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司（美国），胶原酶Ⅷ和脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）购自Sigma Aldrich公司（美国）。另有试剂IL-23（R&D Systems，美国）、雷帕霉素（Selleck Chemicals，美国）、小鼠调节性T细胞染色试剂盒（eBioscience，美国）、PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa，日本）、SYBR Green核酸荧光染料（Applied Biosystems，美国）。实验中所用到的仪器主要有BD FACSAriaTMⅢ流式分选仪（BD Biosciences，美国）、BD LSRFortessaTMX-20流式分析仪（BD Biosciences，美国 ）、7500 Fast Real-time PCR仪（Applied Biosystems，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠肠道固有层淋巴细胞的分离 小鼠脱颈处死后取出肠道，剥除上面附着的脂肪，剪去派氏结（Peyer′s patch），沿纵向剪开，放入磷酸盐缓冲液（PBS）中震荡清洗，去除粪便。之后剪成1～2 cm的小段，先放入含有1 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的PBS中震荡10 min，再转移到含30 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）和10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）的10 mL PBS中震荡10 min。然后用含有0.05% DNaseⅠ和100 U/mL胶原酶Ⅷ的4 mL RPMI 1640培养基37 ℃培养90 min。消化结束后剧烈晃动使组织细胞分散并用孔径100 μm的细胞过滤器过滤，然后在室温下以500×g离心20 min，从80%和40%Percoll梯度液的中间层收获单个核细胞，得到肠道固有层淋巴细胞（lamina propria leukocyte，LPL）。

1.2.2 流式染色 得到的肠道LPL先按1:100加入Fc端封闭剂（CD16/32），4 ℃孵育10 min。细胞表面蛋白如CD3、CCR6、CD11b、CD45、CD11c等的染色按1:200比例稀释抗体，4 ℃避光孵育30 min，然后PBS洗去抗体。对于细胞内部蛋白如IL-22及核内转录因子如RORγt的染色，先用小鼠调节性T细胞染色试剂盒将细胞固定透化1 h，再按1:100比例稀释胞内抗体，4 ℃避光孵育1 h，PBS洗去抗体，最后用200 μL PBS重悬细胞。过程中离心程序均为400×g，5 min。

1.2.3 实时荧光定量PCR 分选获得的细胞先用TRIzol试剂抽提出RNA，检测RNA浓度，并用PrimeScript RT试剂盒反转录成cDNA。使用SYBR Green试剂盒和不同的引物组进行实时荧光定量PCR（real-time qPCR），每个样本设置3个复孔，检测程序为95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 15 s，40个循环；60 ℃ 1 min。结果是相对于次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine phosphoribosyl transferase，Hprt）基因标准化的相对表达值，并根据2-ΔΔCT方法统计。实验中所用到的引物序列见表1。

表1 Real-time qPCR引物Tab 1 Primer sequences for real-time qPCR

1.3 统计学分析

本实验中的数据使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析，定量资料用±s表示；2组间差异的比较采用非配对Student′st检验计算。统计图中所用样本数据均来源于2个及以上独立的实验结果，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 体外雷帕霉素刺激抑制ILC3分泌IL-22

雷帕霉素是mTORC1信号通路的特异性抑制剂，对野生型C57BL/6小鼠肠道LPL用雷帕霉素体外刺激6 h，流式细胞分析检测ILC3数量（RORγt+细胞）及IL-22的分泌情况。结果显示0.1 mg/mL雷帕霉素处理后，ILC3比例及数量无变化，但分泌的IL-22明显减少（图1）；图中也可观察到RORγt阴性的非ILC3细胞IL-22产生能力不受影响，这提示mTORC1对ILC3功能具有调控作用。

图1 雷帕霉素对ILC3分泌IL-22的抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of rapamycin on IL-22 secretion of ILC3

2.2 IL-23刺激后ILC3中Rptor mRNA水平表达上调

上述rapamycin刺激LPL实验中，无法排除LPL中其他淋巴细胞对ILC3的干扰作用。故取6～8周龄野生型小鼠肠道LPL，借助流式分选技术获取纯化的ILC3。小鼠肠道ILC3的分选策略为：首先借助侧向散射光（side scatter，SSC）去除成团的细胞，然后根据前向散射光（forward scatter，FSC）和SSC确定淋巴细胞亚群的位置，再利用谱系标记（lineage marker）（CD3、B220、CD11b、CD11c、Ly-6G）定义出Lin-淋巴细胞群，之后通过CD45.2和CD90.2圈出CD45.2lowCD90.2high细胞群，ILC3主要集中在这一群中，最后使用KLRG1和NK1.1排除其中少量的ILC2及ILC1，得到纯化的ILC3（图2A）。对分选获得的ILC3进行RORγt表达水平的回测，结果证实分选得到的ILC3中RORγt阳性的比例达到90%以上（图2B）。

IL-23是激活ILC3的主要上游信号，活化后的ILC3可分泌更多的IL-22等细胞因子，调节肠道稳态。将利用上述方法分选出来的ILC3用10 ng/mL IL-23刺激24 h，然后通过real-time qPCR检测Rorc和Il22的mRNA表达水平，发现与已有的研究结果一致，这2种基因的mRNA表达均上调。结果还显示，mTORC1的关键组成蛋白Raptor的mRNA表达水平也同步上调（图2C）。上述结果提示，mTORC1可能在ILC3分泌IL-22的过程中起调控作用。

图2 ILC3的纯化及IL-23对其Rorc、Il22和Rptor mRNA表达的影响Fig 2 Purification of ILC3 and effect of IL-23 on Rorc, Il22 and Rptor mRNA expression

2.3 mTORC1功能缺失不影响小鼠肠道ILC3的数量

为了进一步探究mTORC1在小鼠肠道ILC3中的作用，用Rptorflox/flox小鼠（下文简称为WT小鼠）与Rorc-cre转基因小鼠杂交，从而获得只在表达RORγt的细胞中特异性敲除Rptor基因的小鼠Rptorflox/floxRorcCre（下文简称为KO小鼠），该小鼠是研究mTORC1功能缺失常用的工具小鼠。首先用real-time qPCR验证Rptor的敲除效率，KO小鼠ILC3中RptormRNA表达水平显著降低，说明条件性敲除小鼠构建成功（图3A）。

借助流式细胞技术进一步分析小鼠结肠ILC3及ILC3中各亚群的比例及数量，发现WT小鼠和KO小鼠之间并无明显差异（图3B、C）。随后，又比较了稳态下WT小鼠和KO小鼠小肠及结肠长度和肠道派氏结的数量，仍无明显差异（图3D、E）。最后，通过苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H-E染色）对比了WT小鼠和KO小鼠结肠结构，结果显示特异性敲除Rptor后并未使稳态下肠道结构发生明显改变（图3F）。

图3 KO小鼠与WT小鼠ILC3及ILC3中各亚群的比例及数量和肠道结构观察Fig 3 Ratios and numbers of ILC3 and ILC3 subsets and observation of intestinal structure in KO mice and WT mice

2.4 mTORC1功能缺失抑制ILC3分泌IL-22的能力

鉴于上述KO小鼠结肠的ILC3数量没有发生变化，后续实验检测了KO小鼠结肠ILC3活化后分泌细胞因子的能力是否发生改变。流式细胞分析结果显示，在使用1 ng/mL IL-23刺激8 h后，相比WT小鼠，KO小鼠分泌IL-22的量显著减少（图4A），但分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GMCSF）的能力不变（图4B）。相应地，在分选出WT小鼠和KO小鼠肠道ILC3后，使用1 ng/mL的IL-23刺激8 h，通过real-time qPCR检测Il22mRNA及编码GM-CSF的基因Csf2mRNA水平，结果与流式细胞分析结果一致（图4C）。

图4 Raptor缺失后ILC3分泌IL-22的能力Fig 4 Ability of ILC3 to secrete IL-22 after Raptor-deficiency

3 讨论

肠道免疫系统稳态的维持依赖于分布在肠黏膜上皮和固有层的各类免疫细胞协同作用。ILC3是近年来发现的一类免疫细胞亚群，主要富集于肠道黏膜组织，在肠道免疫稳态和微生物防御中发挥重要作用[1-2]。在肠道生理稳态下，共生微生物来源的相关信号首先促使巨噬细胞及树突状细胞等分泌IL-23和IL-1β，两者作为ILC3的主要上游信号，可使ILC3活化并分泌细胞因子IL-22和IL-17A等；其中，IL-22被认为对肠道屏障稳态起着正向调控作用。IL-22主要参与促进上皮细胞抗菌肽及黏液的生成、上皮细胞增殖和岩藻糖基化以及组织修复等过程，从而维持肠道屏障稳态[10-12]。研究[8]表明，ILC3中IL-22分泌缺失或低下可导致肠道细菌感染。ILC3和辅助性T细胞（Th17、Th22）均可产生IL22，但ILC3已被证实是肠道稳态下IL-22的主要来源。关于ILC3中IL-22分泌的调控已有报道，主要集中在转录水平，如芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，Ahr）及转录因子STAT3等都参与诱导IL-22的生成[23-24]，但仍存在很多未知的调控机制。

本研究先借助体外雷帕霉素刺激LPL实验发现mTORC1对ILC3功能具有调控作用，又在IL-23刺激ILC3活化过程中观察到编码IL-22和mTORC1关键组分蛋白Raptor的基因mRNA表达水平同步上调，猜测mTORC1可能参与调控ILC3中IL-22的生成。通过构建Rptorflox/floxRorcCre特异性基因敲除小鼠，发现ILC3缺失Raptor后其分泌IL-22的能力受损，但并未影响小鼠结肠ILC3及ILC3亚群的数量，这说明mTORC1调控了ILC3的功能，但并未影响ILC3的发育。同时肠道稳态下在KO小鼠中未观察到肠道结构损伤，这可能是由于肠道稳态下IL-22分泌减少后机体内存在其他代偿机制。

综上，本研究主要发现mTORC1功能缺失后导致ILC3分泌IL-22能力下降，鉴于IL-22在肠道抗微生物感染中的重要作用，提示mTORC1可能参与肠道稳态维持和抗感染的过程。后续我们将通过鼠类柠檬酸菌感染模型进一步验证。另外，已有研究[25]发现mTOR依赖性的糖酵解等代谢程序调控了Th17细胞的增殖和效应功能。鉴于ILC3和Th17细胞之间的相似性，mTORC1对ILC3功能的调控是否也通过相关代谢通路仍需进一步探究。