两种检测血型抗体IgG亚型的方法比较

马印图, 陈 莉, 张 怡, 董书文, 王振雷, 杨晓亚, 王少文, 李莉华

(1.河北省石家庄市联勤保障部队第九八〇医院输血科，河北 石家庄 050082 2.河北省血液中心，河北 石家庄 050071)

新生儿溶血病(hemolytic disease of the newborn，HDN)是由于胎儿与其母亲之间血型不相同，胎儿的少量红细胞经过胎盘出血进入母亲体内，刺激孕妇产生了针对胎儿红细胞的血型特异性抗体，这些抗体进而破坏胎儿的红细胞，引起胎儿和/或新生儿发生免疫性溶血反应，严重者可引起死胎或高胆红素脑病的严重后果。新生儿溶血的轻重与多种因素有关，其中与血型抗体IgG亚型有直接关系。由于检测方法的差异新生儿高胆红素血症的发生率在30～60%之间[1]。文献报道孕母血液中IgG1和IgG3亚型的含量与新生儿是否发病密切相关[2]。我们研究建立了微柱凝胶技术检测血型抗体IgG亚型的试验方法，与目前临床常用的ELISA方法进行平行试验，对孕妇及其产后新生儿血液标本进行了IgG亚型分析，评价两种方法检测IgG亚型与新生儿溶血病的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例资料:2018年1月至2018年12月在我院产科检查的血型抗体高效价孕妇62例，其中孕妇血型为O型，Rh阳性，丈夫血型为A、B或AB型57例，免疫性抗A(B)效价≥512；Rh(D)阴性孕妇5例，抗D效价≥64，孕妇年龄22～41岁，平均(29.5±0.5)岁，无输血史及药物过敏史，非近亲结婚，产后有27例新生儿经溶血三项试验检测确诊和可疑HDN的血液标本也同步进行了IgG亚型检测，对比观察两种方法检测IgG亚型的一致性，分析血型抗体效价以及IgG各亚型与新生儿溶血病的相关性。

1.2 方 法

1.2.1 血型单抗试剂、0.2mol/L 2-巯基乙醇液(2-Me)、试剂红细胞由上海血液生物医药公司提供, liss/Coombs微柱凝胶卡、专用离心机、恒温孵育器由瑞士达亚美公司生产,IgG亚型微柱凝胶检测卡、专用离心机、孵育器由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供，ELISA法IgG亚型检测试剂盒(美国Sigma公司提供)。

1.2.2 血型鉴定、抗体效价测定和新生儿溶血三项试验(直接抗球蛋白试验、游离抗体试验、抗体释放试验)操作和结果判定均严格按照文献进行[3,4]，对可疑和确诊为与血型有关的HDN及时通知患儿的主治医师。

1.2.3 IgG亚型检测:MGTA试验方法和步骤按照文献进行[5]。采集O型孕妇4mL外周血,分离后取血清200ul与等量2-Me于试管中混合，37℃处理30min破坏血清中的IgM类抗体，对处理后血清进行倍比稀释4、8、16、32……，取一张IgG亚型检测卡，标记编号姓名，在检测卡上面反应孔中分别加入倍比稀释血清25ul和0.6% 标准试剂红细胞悬液50ul,37℃条件下孵育15min，专用离心机离心5min,取出检测卡判读结果，同一份样本进行IgG亚型定量分析，采用ELISA方法进行平行检测，操作步骤严格按试剂盒说明书进行，对两种方法的检测结果进行统计学分析。

1.3 统计学方法:应用SPPSS 13.0软件做统计学处理，孕妇IgG抗体亚型及各升高例数与HDN发病率的关系采用卡方检验,MGTA方法检测结果以2为底数取对数后与ELISA方法检测结果比较采用配对t检验、Spearman相关分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

MGTA检测方法与ELISA方法之间实验结果的一致性较好，前者操作更加简便、快速，适合临床常规可及的方法。新生儿及其母亲体内IgG1和IgG3的含量与溶血的严重程度具有明显的相关性，特别是IgG1的含量与血型不合HDN密切相关。

2.1 两种方法检测IgG亚型结果比较:对62例高效价孕妇采用MGTA法和ELISA方法平行检测了IgG亚型，孕妇血清中各亚型检测结果进行了比较，差异无统计学意义，t=0.3147,P>0.05，结果见表1。

表1 两种方法检测孕妇血型抗体IgG亚型试验结果n(%)

注： *与ELISA方法比较，P>0.05

2.2 新生儿IgG亚型与溶血情况:新生儿经血清学溶血三项试验检测有27例可疑和确诊与血型相关的HDN，采用两种方法进行IgG亚型检测，其中13例发生了ABO系统HDN,3例Rh系统HDN，部分患儿表现为多种亚型同时升高，9例重度HDN患儿实施了换血治疗。两种方法均检测出产后溶血新生儿血清中IgG1、IgG3的含量升高, 多数以IgG1为主,二者比较差异无统计学意义(P>0.05),提示患儿血清中IgG1和IgG3的含量,特别是IgG1的含量与血型不合HDN存在较大的相关性, 换血的HDN新生儿血清中同时伴有IgG1和IgG3亚型含量增高，结果见表2。

表2 新生儿IgG亚型与溶血情况(n)

注： *换血的患儿均检测到IgG1、IgG3同时升高

3 讨 论

因母婴血型不合引起的新生儿高胆红素血症在临床上时有发生。产后新生儿能否出现高胆红素血症除了与血型抗体效价的高低有关系外，还与胎盘屏障保护作用、孕妇自身的免疫状态、胎儿营养和耐受能力等多种因素有关[6,7]，有报道胎儿溶血轻重与IgG抗体亚型密切相关[8，9]。在IgG抗体的4个亚型中IgG1含量最高，其激活补体的能力也最强，而IgG2和IgG4亚型相对较弱。国内有文献报道孕妇血液中血型抗体IgG1和IgG3亚型,特别是IgG1亚型的含量与ABO系统的HDN密切相关[10，11]。目前，临床检测IgG抗体亚型的试验方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞仪检测技术，这两种方法的检测试剂均为进口试剂，存在的不足是反应时间长、操作相对繁琐、试剂价格昂贵，不适合普通实验室常规应用。近年来，临床输血试验中已经普遍采用微柱凝胶检测技术(MGTA)[12]，我们自主研发了微柱凝胶技术检测IgG抗体亚型的试验方法，通过筛选最佳凝胶微粒、在微柱中包被IgG亚型的单抗，对检测技术的特异性、稳定性和重复性等条件进行了优化，与流式细胞仪检测技术进行比较和评价，成功构建了MGTA检测血型抗体IgG亚型的试验方法，试剂满足国家关于微柱凝胶检测卡的产品技术要求，并申请了国家专利(专利号201710386556.2)。本研究采用该技术与目前临床常有的ELISA方法平行进行了高效价孕妇血型抗体IgG亚型检测，二者的实验结果呈明显的正相关。国外文献报道，在Rh系统引起的HDN试验中, IgG1是胎儿红细胞上致敏的主要抗体，约占溶血患儿总数的97%，IgG3占3%,并由此判断IgG1是主要的致病抗体,但病情的进展和严重程度与IgG3有关。本研究结果也证实了这一点，IgG亚型的含量和临床表现与文献报道的基本相符。综上所述，MGTA技术与ELISA方法两种试验在检测血型抗体IgG亚型方面的结果一致性较好，我们建立的MGTA技术检测血型抗体IgG亚型的试验方法简便、快速、灵敏度高、实用性强，一个小时即可完成检测，普通实验室即可常规开展，适合临床实验室推广应用，对于早期诊断和干预治疗母婴血型不合HDN具有重要意义。