加味五虎追风散对帕金森病模型大鼠多巴胺能神经元氧化应激水平的影响

张兴博，梁健芬，徐柳炎

（广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530021）

帕金森病（parkinson’s disease，PD）是以黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元缺失，胞内出现路易小体（lewy bodies，LBs）为主要病理特征的老年常见运动障碍疾病。PD的发生与线粒体功能缺陷、氧化应激、免疫异常、细胞凋亡等多种因素有关［1-4］，其中氧化应激反应增强是导致DA能神经元死亡的主要因素之一。迄今为止，PD的西医治疗仍以改善症状为主，不能阻止疾病进展，其治疗包括药物、外科手术以及处于研究阶段的神经干细胞移植、基因治疗等，但由于临床上各种疗法均存在不同程度的并发症和副作用，严重影响了PD患者的生存质量。课题组前期研究发现加味五虎追风散治疗PD具有良好疗效，可显著改善患者的运动症状，而且与西药合用还可降低西药的副作用，从而提高患者生活质量。本研究以鱼藤酮葵花油乳化液诱导建立PD大鼠模型，观察加味五虎追风散对PD模型大鼠氧化应激反应的影响，以探讨其治疗PD的作用机制，为化痰息风疗法治疗PD提供科学依据。

1 实验材料

1.1 动物 健康Wistar大鼠45只，雄性，体质量200～230 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK桂2009-0002。

1.2 试药与试剂 加味五虎追风散：由蝉蜕6 g、天南星6 g、天麻12 g、全蝎3 g、僵蚕10 g、大地棕根15 g组成，以上中药使用江苏省江阴天江药业有限公司的配方颗粒进行调剂，制成汤药浓度为0.38 g/ml，备用。鱼藤酮（Rotenone），货号R8875，购自Sigma公司，使用时配制浓度为2 mg/ml，每天剂量为2 mg/kg。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒，货号：A005-1；谷胱甘肽（glutataione，GSH）试剂盒，货号：A006-1-1；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒，货号：A001-1；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒，货号：A003-1-2；以上试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，编号：ZLI-9045；TH免疫组化试剂一抗、二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，货号：A14419。

2 实验方法

2.1 动物分组与给药 45只大鼠随机分为正常组、模型组、加味五虎追风散组，每组15只。模型组及加味五虎追风散组按文献［5］方法造模，均以2 mg/kg给药剂量在大鼠颈背部皮下注射2 mg/ml的鱼藤酮葵花油乳化液进行造模，每日1次，连续给药4周。正常组同法注射予相同体积的葵花油乳液，造模结束后给予药物干预，加味五虎追风散组每日灌胃给予10 ml/kg加味五虎追风散溶液，正常组、模型组每日给予等量的蒸馏水灌胃。参照CHEN等［6］行为学评分标准，1分：大鼠出现拒捕行为减弱、竖毛、毛色变黄变脏、弓背、主动活动减少；2分：有1分的表现，且主动活动减少明显、动作迟缓，并有震颤或步态不稳；4分：有2分的表现，且步态不稳，或不能直线行走或步行时间向一侧旋转；6分：向单向斜卧，单侧前肢和/或后肢瘫痪，行走困难、进食困难；8分：单侧、前肢和/或后肢完全瘫痪，四肢拘挛，体重大幅度减轻，不能进食；10分：濒临死亡或死亡。2～6分大鼠为PD造模成功。

2.2 黑质区酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化染色 以3.6%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，开胸经心脏以预冷生理盐水常规灌注后立即断头取脑，分离中脑黑质组织，4℃下以4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，连续做冠状切片，片厚5µm，冰冻切片用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗去聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物（optimal cutting temperature compound，OCT），柠檬酸钠溶液煮沸抗原修复，抗体封闭液（1%牛血清白蛋白+0.3%Tritox-100）封闭30min，一抗用小鼠抗TH抗体（1∶10 000）4℃下孵育过夜；二抗分别用生物素化羊抗小鼠及兔抗羊（1∶400）抗体室温孵育2 h；荧光标记卵白素（1∶400）室温孵育40 min；hoechst染核10 min（1∶5 000）。以上步骤每步后均需PBS清洗3次，每次5 min，75%甘油封片。使用荧光显微镜在低倍镜下计数TH免疫反应阳性神经细胞的个数。

2.3 氧化应激指标检测 大鼠断头取脑后分离中脑组织，制备脑组织匀浆液：取脑组织块0.3～0.5 g在冰生理盐水溶液中漂洗，除去血液，滤纸拭干，放入小烧杯内；烧杯中加入冷的0.86%NaCl溶液0.65 ml，用眼科剪剪碎脑组织块；剪碎的脑组织混悬液倒入匀浆管中，并加入冰的0.86%NaCl溶液0.3 ml进行匀浆，将匀浆液以4 000 r/min离心15 min；将上清液置-20℃冰箱中贮存，备用。氧化应激指标（GSH、GSH-Px、SOD、MDA）按试剂盒说明书步骤进行检测。

2.4 统计学处理 统计分析采用SPSS21.0统计软件进行。实验数据均采用均数±标准差（x±s）表示，方差齐则组间比较采用单因素方差分析，方差不齐则先将其转换为满足方差齐性检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 加味五虎追风散对PD模型大鼠脑组织氧化应激水平的影响 见表1。

表1 加味五虎追风散对PD模型大鼠脑组织氧化应激反应的影响 （x±s）

表1结果显示，与正常组比较，模型组大鼠中脑黑质MDA含量显著增加（P＜0.01），GSH含量、GSH-Px和SOD活性显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，加味五虎追风散组MDA含量显著减少（P＜0.05），GSH含量、GSH-Px和SOD活性明显增加（P＜0.05）。

3.2 各组大鼠中脑黑质多巴胺能神经元细胞数目的变化 见表2。

表2 各组大鼠中脑黑质部位TH免疫阳性神经元细胞数目比较 （个，x±s）

表2结果显示，正常组大鼠中脑黑质致密区TH免疫阳性细胞表达较多，模型组大鼠中脑黑质致密区TH免疫阳性细胞表达较正常组明显降低（P＜0.01）；经治疗，加味五虎追风散组大鼠黑质致密区TH免疫阳性细胞数目显著高于模型组（P＜0.01）。

4 讨论

PD以肢体震颤、肌强直、随意运动障碍为主要临床表现，属中医学“颤症”范畴，本病病位主要在脑，着于筋脉，关乎五脏，证属本虚标实，肾虚为本病发病之根本，又涉及到肝、脾等脏腑；标实为“内风”“瘀血”“痰浊”而致经脉肢体失控，其中虚以肝肾阴虚为主；实以痰浊血瘀为要［7］。其中瘀既是病理产物，更是致病因素，而且在PD的不同阶段均伴随有不同程度的血瘀阻络症状［8］。加味五虎追风散治疗PD具有良好疗效，方中壮药大地棕根补肾活血、生髓荣脑，恰对病机，故为君药；全蝎长于活血，僵蚕功在化痰，天麻善于息风，三者相配共起活血通络、化痰息风之功，共为臣药；蝉蜕祛风止痉，天南星解痉止颤，二者共为佐药；诸药相配，共奏补肾填精、化瘀通络、祛痰息风之功。

鱼藤酮是豆科藤本植物鱼藤根部的一种活性成分，其作为广谱杀虫剂和鱼毒已被长时间使用。大量流行病学及动物实验表明鱼藤酮有选择性的多巴胺神经元毒性，可以使鼠科动物产生与PD相似的症状，还因其脂溶性强，能很好地穿透血脑屏障［9］，故可用于PD模型大鼠制作。且鱼藤酮诱导PD大鼠的成模率较高，在病理、生化、致病机制、行为学等方面均能较好地模拟PD相关特征［10］，氧化应激损伤是鱼藤酮导致大鼠脑内DA能神经元损害的主要机制［11］。鱼藤酮可与线粒体复合物1结合并抑制其活性，阻断细胞呼吸链的递氢功能和氧化磷酸化过程，产生自由基和凋亡诱发因子，从而产生细胞毒作用。

PD是以黑质纹状体DA能神经元缺失为主要特征的疾病，其发病与氧化应激、线粒体功能障碍及α-突触核蛋白异常聚集有关［12］，其中氧化应激被认为是PD黑质神经元细胞死亡病理机制的主要因素［13］，在PD发病过程中，当体内氧自由基的产生与清除失平衡后可导致活性氧及氧自由基在体内堆积，清除自由基是减少黑质DA能神经细胞死亡的主要方式，而体内清除自由基的酶系统主要包括SOD、GSH-Px及过氧化氢酶等抗氧化酶［14］。GSH为一种低分子自由基清除剂，可清除H2O2、O2-，并维持细胞内环境稳定，使暴露于氧化环境的组织免受自由基损害［15-16］，其含量的多少是衡量机体抗氧化能力的重要指标。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化H2O2分解的酶，可特异催化GSH对H2O2的还原反应，对细胞结构和功能的完整具有重要保护作用。而SOD与MDA是反映氧化应激的两个指标，SOD通过歧化反映清除自由基，对氧化损伤起保护作用，其活力的高低反映了机体清除自由基的能力［17］，被看作是氧化应激的直接指示剂；MDA是受到氧自由基攻击后形成的一种最终代谢产物，可间接反映组织受自由基攻击的严重程度［18］。本实验结果提示加味五虎追风散能够明显增加PD大鼠DA神经元GSH的含量，增加GSH-Px和SOD活性，降低丙二醛的含量，减少自由基的生成，增强机体清除自由基的能力，从而减轻氧化应激反应对机体的损害，以达到治疗效果。

本实验研究表明，鱼藤酮诱导的PD模型大鼠中脑黑质MDA含量显著增加，GSH含量、GSH-Px和SOD活性显著减少，黑质TH免疫阳性神经元数目明显减少，表明PD动物模型造模成功。经加味五虎追风散组干预后，PD模型大鼠脑组织中GSH-Px、SOD活性和GSH的含量明显增加，MDA的含量明显减少，黑质TH免疫阳性神经元数目明显增加，表明加味五虎追风散对PD模型大鼠DA能神经元具有保护作用，其机制可能与加味五虎追风散减轻鱼藤酮所致的氧化应激损伤有关。随着对氧化应激介导的PD发病机制的深入研究，对PD抗氧化应激的治疗必将得到更多的认识和发展，也为临床治疗和预防帕金森病提供新的实验依据。