杜仲EuGT4基因原核表达及其编码蛋白纯化

龚伟伟， 赵懿琛，2*

(1.贵州大学 茶学院， 贵州 贵阳 550025； 2.山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室/贵州省农业生物工程重点实验室， 贵州 贵阳 550025)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)又名胶木，为杜仲科杜仲属植物，是我国特有的一种名贵中药材，通常以树皮入药[1]，具有降压、调血脂、降血糖等药理作用[2]。杜仲的药用活性成分主要有环烯醚萜类、脂肪酸类、木脂素类和黄酮类等[3]。其中研究较多的为木脂素类[4]，目前已从杜仲中分离出木脂素类化合物27种，其中的松脂醇二葡萄糖苷是主要的降压成分，其含有的糖苷结构在调节血压中发挥极其重要的作用[5]。糖基转移酶(Glucosyltransferase，GT，EC 2．4．x．y)以UDP-Sugar为糖基供体，是植物中一大类催化糖苷取代反应的酶，在植物体内催化活化的糖连接到不同受体合成糖苷[6-7]，参与木质素类、类黄酮、类固醇等产物的生物合成，对植物次生代谢、非生物胁迫以及调节激素活性等方面发挥着重要作用[8-9]。糖基化是在糖基转移酶作用下，将糖转移至蛋白质形成糖苷键，对调节蛋白功能有重要作用[10]。基因原核表达可用于研究目标蛋白质的结构和功能[11]。研究以贵州省农业生物工程重点实验室前期克隆得到的杜仲糖基转移酶编码基因EuGT4为基础，构建EuGT4基因原核表达载体，并遗传转化大肠杆菌，从转化菌株中鉴定出目标基因表达的56 kD蛋白质，旨在为进一步研究杜仲糖基转移酶结构和功能提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1杜仲EuGT4基因利用贵州省农业生物工程重点实验室构建的杜仲(EucommiaulmoidesOliver)基因组数据库注释信息，从杜仲克隆得到全长1 461 bp的糖基转移酶cDNA序列(图1)，预测其蛋白分子量为56 kD。

1.1.2试剂二硫苏糖醇(DTT)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)乙二胺四乙酸(EDTA)、尿素(Urea)、氯化钠(NaCl)、甘油(Glycerol)、咪唑(咪唑)、IPTG、硫酸卡那霉素和TritionX-100购自生工生物工程(上海)股份有限公司(BBI)，Ni-IDA琼脂糖凝胶、SDS-PAGE上样缓冲液、SDS-PAGE电泳缓冲液、SDS-PAGE预制胶、ECL试剂盒、SDS-PAGE Marker、T4 DNA连接酶和WB Marker购自德泰生物科技(南京)有限公司， Taq DNA聚合酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2方法

1.2.1原核表达载体的构建将EuGT4基因插入含有限制性酶切位点NdeI和HindIII的pET30a表达载体，碱裂解法提取质粒，NdeI/HindIII酶切后用琼脂糖凝胶电泳检测，并将构建的质粒送德泰生物科技(南京)有限公司进行测序。测序结果正确后，利用热激法将pET30a-EuGT4转入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，在超净台内用涂布棒均匀涂布于含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。载体结构见图2。

1.2.2EuGT4重组蛋白的诱导表达从含50 μg/mL的硫酸卡那霉素的LB平板上挑取单个阳性克隆，在无菌操作下将其接种到含50 μg/mL的硫酸卡那霉素4Ml LB培养基中。紫外分光光度计测定菌液OD600为0.6左右时，向菌液里加入IPTG使其终浓度为0.2 mM，然后在15℃和37℃恒温培养箱中分别诱导表达。

图2 质粒载体结构

Fig.2 Plasmid vector structure

1.2.3EuGT4重组蛋白的表达形式鉴定诱导表达后的菌液离心后除去上清液，沉淀在20 mM 咪唑含1% Triton X-100、1 mM PMSF、50 mM Tris(pH8.0)、1 mM DTT、50 mM Tris(pH8.0)以及300 mM NaCl混合溶液中重悬，然后在冰上于超声破碎仪中超声裂解。Ni-IDA亲和层析柱用含有20 mM 咪唑、300 mM NaCl以及50 mM Tris(pH8.0)的混合溶液进行平衡，用浓度为50 mM、100 mM和300 mM的咪唑在Ni-IDA亲和层析柱上洗脱目的蛋白，取洗脱组分20 μL进行SDS-PAGE检测。

1.2.4EuGT4重组蛋白的纯化与复性用含有300 mM NaCl (1% Triton X-100)、2 mM EDTA、50 mM Tris(pH8.0)以及5mM DTT混合溶液洗涤包涵体，4℃、12 000 rpm离心5 min，然后用含有20 mM咪唑、300 mM NaCl、8 M 尿素以及50 mM Tris(pH8.0)的混合溶液溶解包涵体沉淀。最后用浓度50 mM、100 mM和300 mM的咪唑在Ni-IDA亲和层析柱上洗脱目的蛋白，取洗脱组分20 μL进行SDS-PAGE检测。根据邹情等[12]描述的方法，对纯化后的EuGT4重组蛋白进行透析复性分析。

1.2.5EuGT4重组蛋白的Western Blot鉴定根据罗显麟等[13]描述的方法，对得到的EuGT4重组蛋白进行Western Blot鉴定。

2结果与分析

2.1原核表达载体的构建

对构建的原核表达载体进行双酶切验证，在限制性内切酶NdeI和HindIII处理后，可获得一条约1 500 bp大小的酶切片段，该片段大小与目标基因大小相符(图3)。

注：1,质粒DNA；2,NdeI/HindIII酶切；3,DNA Marker。

Note: 1, plasmid DNA ; 2, digested with NdeI/HindIII;3, DNA Marker.

图3 pET30a-EuGT4酶切胶图

Fig.3 pET30a-EuGT4 digestion gel map

2.2EuGT4重组蛋白的表达

分别在15℃和37℃2个不同诱导温度下对含有目标载体的菌体进行诱导表达，在IPTG(0.2 mM)诱导16 h后，可在37℃诱导组中获得一条相对分子质量大小为50 kD的特异性的蛋白条带，该特异性条带大小与生物信息学预测的目标蛋白的大小基本相符，初步判断为表达的EuGT4的重组蛋白(图4)。

注：M, SDS-PAGE蛋白Marker; 0,对照(不加IPTG)；1,15℃诱导16 h；2, 37℃诱导16 h.

Note: M, SDS-PAGE protein Marker；0, CK(no addition with IPTG);1, induced for 16 h at 15℃; 2, induced for 16 h at 37℃.

图4 EuGT4蛋白在BL21(DE3)表达情况

Fig.4 Expression of EuGT4 protein in BL21 (DE3)

2.3EuGT4重组蛋白的纯化与复性

通过前期诱导实验确定在0.2 mM的IPTG诱导下，37 ℃诱导16 h为最佳诱导条件。对目标蛋白进行大量表达。由于EuGT4重组蛋白主要以包涵体的形式在沉淀中存在，因此需对目标蛋白进行纯化及复性。利用含 Ni 柱的蛋白亲和层析对蛋白进行纯化，分别收集50 mM、100 mM和300 mM咪唑洗脱组分进行SDS-PAGE检测(图5)，以期获得高纯度的EuGT4重组蛋白。

通过纯化分析结果发现，300 mM的咪唑浓度下EuGT4重组蛋白的浓度最大,可获得纯度较高的可溶性的重组蛋白(图6)。经透析复性并去除高浓度尿素后，可恢复其蛋白空间构象，得到具有生物活性的蛋白，可用于后续相应抗体的制备。

注：M,蛋白Marker；1,全菌裂解的上清；2,上清纯化后流出液；3,洗脱组分(50 mM 咪唑)；4,洗脱组分(100 mM 咪唑)；5～6,洗脱组分(300 mM 咪唑)。

Note: M, protein Marker; 1, supernatant lysed by whole bacteria; 2, supernatant after purification; 3,elution fraction (50 mM imidazole); 4, elution fraction (100 mM imidazole); 5-6, elution fraction (300 mM imidazole).

图5 EuGT4蛋白纯化分析

Fig.5 Purification analysis of EuGT4 protein

注：M,蛋白Marker；1,离心后的包涵体上清； 2,上清纯化后流出液；3,洗脱组分(50 mM 咪唑)；4～6,洗脱组分(100 mM 咪唑)；7～8,洗脱组分(300 mM 咪唑)。

Note: M, protein Marker; 1, inclusion supernatant after centrifugation; 2, supernatant after purification; 3,elution fraction (50 mM imidazole);4-6, elution fraction(100 mM imidazole); 7-8, elution fraction (300 mM imidazole).

图6 包涵体纯化分析

Fig.6 Purification analysis of inclusion bodies

2.4EuGT4重组蛋白的鉴定

利用重组EuGT4蛋白所携带的His标签蛋白的对应抗体对重组蛋白进行Western Blot鉴定，在相对分子质量约50 kD处获得一条特异性目标条带，其大小与重组蛋白相符，表明已成功获得His- EuGT4重组蛋白(图7)。

注： 1: BSA (1.50 μg)； 2:EuGT4基因蛋白(1.20 μg)；M1: SDS-PAGE蛋白Marker；M2: Western Blot 蛋白Marker。

Note: 1, BSA (1.50 μg); 2, EuGT4 gene protein (1.20 μg); M1, SDS-PAGE protein Marker; M2, Western Blot protein Marker.

图7 EuGT4重组蛋白Western Blot检测

Fig.7 Western Blot detection of EuGT4 recombinant protein

3结论与讨论

糖基转移酶广泛地存在于植物体内，其表达量的提高对植物既有利又有弊。有研究表明，糖基转移酶基因3GT在天山雪莲中过表达后，测定转基因愈伤组织和WT愈伤组织中的总黄酮含量，数据显示前者明显高于后者[14]。而糖基转移酶UGT84B1基因在拟南芥中过表达，会破坏转基因拟南芥中的IAA糖基化过程，从而使根失去向地性[15]。前人研究还发现，糖基转移酶和非生物胁迫之间也存在一定关系，从拟南芥中克隆得到UGT79B2/79B3基因能将鼠李糖基转移到花青素和3-O-葡萄糖分子上，提高植物的抗逆性[16]；糖基转移酶UGT76E11基因的异位表达增加拟南芥类黄酮的积累，增强其抵抗非生物胁迫的能力[17]。

随着科技的不断提升，人们对原核表达系统的遗传背景更加明晰，原核表达系统因其外源蛋白表达水平高且纯度能达90%以上、成本低及周期短等优势而被大量应用于外源基因表达[18]。邹情等[12]构建Dirigent基因原核表达载体成功使其在BL21 (DE3)中主要以包涵体的形式表达，对包涵体进行复性纯化后得到可溶性且纯度较高的重组蛋白。冷阳等[19]对杜仲EuGT2基因进行原核表达，杜仲EuGT2基因以部分可溶性蛋白、部分包涵体的表达形式在E.coli Rosetta (DE3)中得到成功表达；罗显麟等[12]对花烟草NaD1基因的进行原核表达，确定最优表达条件并在上清中获得可溶性的蛋白。

研究根据1个已克隆的杜仲糖基转移酶编码基因EuGT4，利用基因重组技术构建原核表达载体pET30a-EuGT4，遗传转化大肠杆菌BL21(DE3)，在37℃条件下以终浓度为0.2 mMol/L的IPTG诱导表达16 h，通过Ni-IDA亲和层析柱进行纯化，得到以包涵体的形式在BL21(DE3)中表达的EuGT4重组蛋白，分子量约为50 kD，研究结果为进一步研究杜仲糖基转移酶功能提供了科学依据。