基于WNT/β-catenin信号通路研究DMBT1调控慢性肾小球肾炎发生发展的作用机制

卢作奎 许为佳 史秀岩

442000 十堰，湖北省十堰市太和医院肾内科

慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis，CGN)是慢性肾脏病(CKD)的主要组成部分，也是终末期肾病最常见的病因。近年来，CGN发病率和死亡率呈不断上升的趋势；CGN的发生不仅给病人带来了极大的痛苦，同时也带来了巨大的社会负担。CGN的特点是慢性炎症、免疫异常、血管重塑、氧化应激、肾功能丧失、肾小球和肾小管间质瘢痕口等[1-2]。其发病的确切机制尚不清楚，有少数CGN是由急性肾炎发展所致，约占15～20%。大多数CGN由各种肾小球疾病发展而来，表现为慢性起病。

DMBT1是一种分子量为340 kDa的糖蛋白，包含14个半胱氨酸受体结构域重复序列(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)，2个C1r/C1s-Uegf-BMp1结构域和一个羧基末端透明带结构域[3-4]。DMBT1由已知的介导蛋白-蛋白相互作用的氨基酸序列组成，其功能是作为革兰氏阳性和阴性细菌的模式识别分子。有报道指出，DMBT1基因表达下调参与多种髓母细胞瘤细胞的发生发展[5]。另有报道显示DMBT1在正常胃粘膜和胃肿瘤中的异常表达，作为肿瘤相关性基因参与肿瘤调控[6]。最近的研究表明：DMBT1参与炎症和组织纤维化过程中免疫反应的调节，与慢性炎症、组织纤维化异常等相关[7]。但目前尚无DMBT1在CGN中的作用研究。因此，本文通过研究DMBT1在CGN组织的相对表达和甲基化，及DMBT1对人肾小球足细胞(human glomerular podocyte，HPC)迁移的影响，以揭示其在CGN中的作用，为CGN的治疗寻找相应的靶点。

资料与方法

一、实验试剂与研究对象

1.主要试剂 HPC细胞购于上海生科所细胞库。胰蛋白酶、胎牛血清和1640培养液等购买于美国CST公司；本课题中引物由深圳华大基因设计并合成，本研究中引物见表1。DNA提取试剂盒套装购买于美国Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒和实时荧光半定量PCR购买于上海碧云天实验公司；组织蛋白提取试剂盒购买于美国赛默飞生物科技公司。本课题中大型仪器和设备主要包括恒温细胞孵育箱、生物细胞安全柜、实时荧光定量PCR仪和蛋白电泳凝胶成像仪等，由太和医院公共实验平台提供。

2.研究对象 选取十堰市太和医院2015年1月至2018年12月收治的86例CGN患者。CGN的诊断参考2003年国际肾脏病学会和肾脏病理学会联合制定的国际标准及已有的文献报告[8]。纳入标准：(1)存在3个月及以上的肾脏功能或结构异常；(2)存在肾脏病理学检查异常和/或肾脏损伤；(3)存在3个月及以上的肾小球滤过率低于60 mL·min-1·(1.73 m2)-1，有或无肾结构、功能损伤[8]。86例CGN患者中，男性患者54例，女性患者32例，年龄11～49岁，中位年龄24.4岁；病程：4个月～6年，平均病程(1.16±0.23)年。纳入患者的主要病理分型包括：系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化等。另外选取我院30例行肾癌手术切除的癌旁正常肾组织(距离肿瘤组织约5 cm)患者作为正常肾脏对照组，其中男性8例，女性12例，平均年龄(62.8±5.6)岁。

二、方法

1.DNA和RNA提取 使用DNA zol套装和QIAamp DNA套装提取肾组织中DNA，提取方法参考试剂盒中的说明书和已有的文献报道[9]。RNA提取方法主要包括：(1)匀浆处理(组织匀浆或细胞消化离心)；(2)将匀浆样品在室温(15～30 ℃)放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离；(3)加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min，得到水相液；(4)异丙醇沉淀水相中的RNA；(5)离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，75%乙醇洗涤RNA沉淀，RNA沉淀干燥后加入无RNase水溶解。提取的RNA逆转录为cDNA，实验方法参考试剂盒中的说明书和已有的文献报道[9]。处理好的cDNA和DNA保存于-80 ℃冰箱保存。

2.甲基化PCR检测 亚硫酸氢盐修饰DNA和甲基化特异性PCR(MSP)方法同已有的文献报道[10]。MSP分析显示，MSP引物在未亚硫酸化的DNA中没有扩增产物，因此具有特异性。MSP在2%含100 bp DNA标记的琼脂糖凝胶上实验；加入AmpliTaq-Gold DNA Polymerase酶，退火温度为60 ℃或55 ℃，反应周期：40 cycles。甲基化和非甲基化人类DNA分别用作阳性和阴性对照。甲基化特异性引物见表1。

表1 实验相关引物

3.半定量PCR检测 实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR，qRT-PCR)的实验方法和统计方法同参考文献[11]，通过qRT-PCR检测DMBT1 mRNA在正常肾上皮组织、CGN患者肾组织中的相对表达；及DMBT1对WNT信号通路相关因子的影响。qRT-PCR上机总反应体系如下：95 °C 5 min；95 °C 30 s；55 °C 30 s；72 °C 30 s；25 °C 10 min。其中内参循环23 cycle，目的循环32 cycle。所有实验独立重复三次。

4.细胞转染 HPC细胞的培养和方法同已有的文献报道[12]。将活性状态下HPC种植于六孔板，当细胞密度生长至80%～90%时进行细胞转染；用脂质体Lipofectamine-2000(invitrogen)进行转染，分别转染对照质粒NEG和目前质粒DMBT1(购买于广州复能基因)。转染后加入细胞孵育箱中继续培养48 h，加入G418进行细胞筛选二周获得稳定表达的细胞系，进行后续功能实验。

5.细胞划痕实验 细胞划痕实验用于检测DMBT1对细胞迁移的影响。将稳定转染的DMBT1转染组和对照组细胞平铺种植于六孔板中(5×105细胞/孔)，加入细胞孵育箱中继续培养，待细胞融合度至90%时进行后续实验。细胞层用无菌的P-20移液管尖刮伤，然后用PBS冲洗两次，小心去除细胞碎片，并在无血清培养基中培养。每12小时于100倍显微镜下拍照，观察细胞的相对迁移率。所有实验独立重复三次。

6.免疫蛋白印迹实验 免疫蛋白印迹(western blot)实验方法的步骤和统计方法同参考文献[13]，当DMBT1质粒或空载体对照进行转染48 h后，从转染细胞中提取蛋白质。然后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离细胞裂解液，然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在PBST中用5%的牛奶封闭1 h后，用DMBT1、β-catenin、active-β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、E-canherin、N-cadherin、Vimentin及SALL1等相关一抗(abcam)4 ℃孵育过夜。第二天常温下复温0.5 h后，PBST液洗膜3次，每次10 min；加入二抗封闭液室温下孵育1～2 h，使用增强化学发光检测系统显示免疫印迹；GAPDH用作对照。所有实验独立重复三次。

三、统计学分析

结 果

一、DMBT1 mRNA和蛋白在CGN组织中表达情况

采用免疫蛋白印迹实验分析DMBT1蛋白在CGN、正常肾上皮组织中相对表达；结果显示：与正常肾上皮组织相比，DMBT1蛋白在CGN组织中表达下调(P<0.01)(图1A)；进一步分析DMBT1蛋白的表达与CGN中临床病理特征的相关性，结果显示DMBT1蛋白表达下调程度与CGN病理类型(P=0.214)、肾功能(P=0.451)及肾纤维化程度(P=0.562)无明显相关性。同时qRT-PCR试验发现，与正常肾上皮细胞相比，DMBT1 mRNA在CGN组织表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)(图1B)。通过免疫组化染色发现DMBT1定位于肾小球细胞胞质中(图1C)，与以往文献结果相一致[5-6]。以上结果提示DMBT1的表达下调可能作为CGN相关基因参与肾病的发生发展。

注：CGN为慢性肾小球肾炎，Normal为正常肾上皮组织图1 DMBT1蛋白及mRNA在不同肾组织中的表达情况 A.DMBT1蛋白在不同肾组织中的表达情况，B.DMBT1 mRNA在不同肾组织中的表达情况，C.DMBT1在肾组织中的定位情况

二、DMBT1在CGN组织中甲基化表达情况

启动子异常甲基化是导致多种抑癌基因表达沉默的重要机制，文献显示DMBT1启动子含有多个甲基岛(CpG岛)序列[14]，提示DMBT1可能作为重要的甲基化基因参与肿瘤的进程。本研究中甲基化PCR结果显示：在绝大多数CGN患者中均发生DMBT1启动子甲基化(甲基化率为83.7%)，但在正常肾组织中却没有甲基化(图2)。因此，我们推测DMBT1基因甲基化可能参与CGN的进程。

注：M为甲基化，U为非甲基化，ddH2O为阴性对照图2 DMBT1在不同肾组织中甲基化表达情况

三、DMBT1对人肾小球足细胞迁移的影响

为进一步探讨DMBT1对HPC细胞迁移的影响，我们进行了细胞划痕实验。结果显示：与对照组相比，DMBT1转染的HPC细胞在48 h后伤口的愈合能力明显延迟，差异有统计学意义(P<0.01)(图3A、3B)。体外细胞培养实验显示，过表达DMBT1后，肾小球足细胞形态发生明显改变(图3C)。因此我们推测DMBT1可能作为肾病相关的功能性基因参与CGN的进程。

图3 DMBT1对肾小球足细胞迁移的影响 A.细胞划痕实验，B.DMBT1转染组与对照组细胞迁移率比较折线图，C.体外细胞培养实验

四、DMBT1对WNT/β-catenin信号通路的作用

分别取DMBT1转染组与对照组细胞，提取总蛋白，采用免疫蛋白印迹法检测WNT/β-catenin以及下游靶基因、上皮-间质转化相关分子的表达水平。结果显示，DMBT1转染后active-β-catenin、C-myc、Vimentin、N-cadherin和Snail1的蛋白表达下调(P<0.01)；E-cadherin的蛋白表达水平上调(P<0.01)。(图4)

注：与对照组比较，aP<0.01图4 DMBT1对WNT/β-catenin信号通路的作用 A.免疫蛋白印迹实验，B.DMBT1转染组与对照组细胞active-β-catenin、C-myc、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、Snail1的蛋白表达水平比较

讨 论

DNA甲基化是一种常见的表观遗传学机制，通过甲基化修饰使基因表达沉默[11]；DNA甲基化主要发生在CpG位点的胞嘧啶残基上，DNA甲基化是维持组织/细胞中基因表达状态特异性的重要机制[11]。在病理学的机制中，异常的DNA甲基化和随之出现基因异常表达可能与许多疾病的发生发展有关，包括癌症、心血管疾病、代谢紊乱(肥胖和糖尿病)和肾脏疾病[15]。在过去的几年中，对CKD患者进行的研究表明：全身DNA甲基化模式与肾功能下降相关[16]。最近一项关于社区动脉粥样硬化风险和心脏疾病患者全血DNA甲基化的表观全基因组关联研究显示，特定CpG位点(如JAZF1中的CG23597162、PTPN6/PHB2中的CG19942083、ZNF788/ZNF20中的CG17944885)的DNA甲基化水平与肾小球滤过率降低、发生CKD或肾功能损害之间存在关联[17-18]。

上皮细胞-间充质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用，其主要的特征有细胞黏附分子(如E-钙黏蛋白)表达的减少、细胞角蛋白转化为波形蛋白为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。EMT是肾脏纤维化的重要环节，而间质纤维化是所有CKD终末期的表现，并最终导致肾功能衰竭[19]。WNT/β-catenin信号通过诱导其靶基因可影响不同生物学行为，与调节器官发育和肿瘤发生密切相关；WNT/β-catenin在肾损伤和纤维化中有部分特异性的靶点，如Snail1等。Snail1是一个关键的转录因子，可影响EMT进程[20]；Snail1转录抑制上皮性钙黏附蛋白的表达，并导致上皮细胞-细胞黏附的破坏，Snail1和β-catenin活化蛋白均上调，β-catenin的激活在体外诱导了肾小管上皮细胞和肾小球足细胞中的Snail1表达，在纤维化疾病中占主导地位。因此，研究CGN患者DNA甲基化及EMT相关调节基因对揭示CGN的发生发展具有重要的临床意义。

本实验发现，DMBT1 mRNA和蛋白在CGN患者中表达明显下调，DMBT1蛋白表达下调程度与CGN病理类型、肾功能及肾纤维化程度无明显相关性；甲基化PCR分析进一步发现，与正常肾组织相比，DMBT1在CGN肾组织中甲基化程度明显升高；提示DMBT1可能作为重要甲基化基因影响CGN的进程。肾小管间质纤维化是影响CGN发展和预后的重要因素，肾小管EMT是肾小管间质纤维化的重要机制。当EMT发生时，肾小管上皮细胞失去了上皮细胞的特性，并促进肾间质纤维化的进展[21-22]。而本研究通过细胞划痕实验发现，DMBT1的表达能影响细胞迁移，提示DMBT1基因甲基化丢失可能与CGN的间质纤维化密切相关。另有文献显示，WNT/β-catenin信号通路及下游的分子靶点与CKD的发生发展密切相关[19-20]。而本研究发现，在肾小球足细胞HPC中，过表达DMBT1基因后，active-β-catenin、c-Myc、cyclinD1、Vimentin、N-cadherin和Snail1的蛋白表达水平降低，E-cadherin的蛋白表达水平升高；因此，我们推测DMBT1可能通过调控WNT/β-catenin信号通路，抑制上皮间充质转变，从而影响CGN的进程。

本研究证实了DMBT1在CGN中的表达及调控，有助于我们进一步的了解CGN的发病及发展的机制，同时使我们了解了肾小球肾炎从蛋白尿到纤维化的分子调控机制，为CGN的治疗提供了新的思路。