PCSK9拮抗剂干预心梗大鼠心肌细胞凋亡及炎症因子表达的机制研究

冯 华，代 涛，陈 铁，谭力力，潘 淼，孙 颖，张秀春

（沈阳医学院附属第二医院，辽宁 沈阳 110035）

细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的主要发病环节之一，而细胞凋亡的多少与缺血再灌注损伤程度存在一定联系[1]。人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）是生物信息方法与DNA微阵列技术中，发现的新的血液胆固醇代谢相关的基因。而目前有研究指出，PCSK9在胆固醇代谢中起到较为重要的作用，并参与细胞凋亡[2]。但PCSK9在心肌缺血再灌注中，是否存在表达，与心肌缺血之间是否存在联系，研究较少[3]。本文通过将心梗大鼠进行研究，观察PCSK9拮抗剂对心肌细胞凋亡与炎症抑制的表达意义，内容如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年9月～2018年9月我院培养的12例大鼠，其中对照组4例，缺血再灌注6 h、12 h各4例。

1.2 方法

均为健康雄性大鼠，按照清洁级动物分笼饲养，适应性喂养1周后，按照随机的原则进行分组。其中对照组为假手术组，只穿线不结扎，观察6 h。所有大鼠均自由饮水。

使用10%水合氯醛麻醉腹腔注射大鼠，并进行颈部气管插管，使用动物人工呼吸机进行机械辅助呼吸，在胸骨左侧1 cm做一纵向切口，打开胸腔，在左心耳根部下方2 mm处进针动脉圆锥旁出针，放松活结即可恢复血流形成再灌注。实验中观察心电图，出现ST段提高或深Q波形成并结扎线以下左心室壁，颜色变灰白，表明模型制备成功，结扎45 min后开放阻断钳，并仔细缝合切口，将腹腔内剩余气体抽尽，并观察大鼠自主呼吸情况，仔细缝合气管切口。手术结束后肌肉注射青霉素，积极预防感染，并适当保暖，喂养生理盐水。对照组仅开胸穿线，但不结扎冠状动脉。在实验终点吗，需要收集血液及缺血区心肌组织，心肌组织使用PBS漂洗，立即置液氮中冷冻保存，血液于室温静置2 h，3000 rpm离心20 min后吸取上层血清，于-20℃保存。

1.3 观察指标

观察缺血/再灌注大鼠心肌组织细胞凋亡情况。

采用ELISA 法检测C 反应蛋白（CRP）、白细胞介素6（IL-6）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）炎症因子情况[4]。

1.4 统计学方法

均采取SPSS 19.0统计软件对本文数据进行分析计算，在计算计数资料的时候采取x2，选择n（%）进行表达，计算计量数据的时候采取t，选择（±s）表达，其中当P＜0.05的时候，数据为差异有统计学。

2 结 果

2.1 缺血/再灌注大鼠心肌组织细胞凋亡情况

使用DNA试剂盒提取各试验组大鼠心肌中的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳检测，其中再灌注6 h、12 h出现凋亡细胞所特有的DNA图谱，且灌注时间越长，梯状条带越明显，提示细胞凋亡程度加重。

2.2 不同大鼠之间炎症表达情况

缺血再灌注12 h组在各项炎症情况上均高于对照组、缺血再灌注6 h，差异显著，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同大鼠之间炎症表达情况[n=4，（±s）]

表1 不同大鼠之间炎症表达情况[n=4，（±s）]

组别 CRP（mg/L） IL-6（ng/L）TNF-α（ng/L）对照组 2.54±0.54 54.52±10.52 60.41±10.25缺血再灌注6 h 4.54±0.85 156.68±15.42 215.69±12.85缺血再灌注12 h 7.34±2.11 342.22±35.34 534.45±62.44 F 12.760 159.800 168.120 P 0.002 0.000 0.000

3 讨 论

目前我国心血管疾病发病率与死亡率逐年出现上升趋势，而缺血性心脏病主要是由于多种原因导致的冠脉血流量不足，难以满足心肌对能量所导致的心肌损害。目前主要采取冠脉搭桥或溶栓治疗，能够改善患者心肌血流供应，并保护缺血心肌，但术后并发症较多，使得效果并不理想[5]。而心肌缺血再灌注是多种作用下的病理作用，其作用机制目前并不清楚，但需要进一步明确心肌缺血再灌注损伤的机制，为临床治疗提供新理论。

本文通过将PCSK9拮抗剂进行研究，选择不同情况的大鼠，结果中：再灌注6 h、12 h出现凋亡细胞所特有的DNA图谱，且灌注时间越长，梯状条带越明显，提示细胞凋亡程度加重[6]。缺血再灌注12 h组在各项炎症情况上均高于对照组、缺血再灌注6 h，差异显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤之间存在较为明显的关系，心肌缺血再灌注，且本文结果中再灌注时间越长的大鼠，且细胞凋亡情况越严重[7]。且有研究在人类心肌梗死的尸检中，也发现了急性心肌梗死的心肌细胞中存在明显的细胞凋亡，出现缺血再灌注损伤。其凋亡细胞主要分布在梗死灶收缩带周围，无梗死区域细胞其凋亡却较少[8]。但PCSK9也已经正式了，其能够促进肝LDLR的讲解，增加患者冠心病与心肌梗死的患病风险；与炎症之间也存在一定联系，使得多项炎症因子出现升高。

综上所述，对于PCSK9拮抗剂干预，心梗大鼠心肌细胞凋亡较为明显，炎症因子将会出现明显升高，且PCSK9参与了心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程。