艾灸对腹泻型肠易激综合征模型大鼠海马与结肠组织中IKKβ/IKBα/NF-κB通路的影响

王 宇，陈 霞，吴立斌，仝 理，李 难，储浩然，3

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；3.安徽省中医药科学院针灸临床研究所，安徽 合肥 230012)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种以腹痛或腹部不适为主，伴有排便习惯改变和(或)大便性状异常，而缺乏胃肠道结构和生化异常的肠道功能紊乱性疾病。临床以腹泻型肠易激综合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)最为多见，症状以腹痛伴排便次数增多，大便性状稀溏、或带有黏液、甚至水样便为主，严重影响患者生活质量[1]。目前IBS常用的治疗方法有解痉剂、止泻药、肠道动力调节药、微生态制剂、抗焦虑药物、饮食等，疗效并不满意，且症状易反复发作[2-6]。针灸对功能性胃肠疾病的防治具有良好的疗效，且不良反应少[7]。

IBS的发病机制尚未完全明确，其发病机制可能与脑-肠轴相互作用、炎症与免疫异常、肠道动力改变、食物、精神心理障碍等有关[8-10]，其中脑-肠轴相互作用和肠道黏膜低度炎症在IBS的发展中起着重要作用[11-14]。核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa B， IκB)激酶β(IκB kinase beta，IKKβ)/核因子κB抑制蛋白α(NF-kappa-B inhibitor alpha， IKBα)/核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号通路被认为与IBS炎症反应表现密切相关[15]，其关键是NF-κB分子从胞质向核内的转移。

近年来，艾灸改善肠道黏膜低度炎症的作用机制是研究的热点，且IBS-D的炎症反应与脑-肠轴密切相关。目前，大多数艾灸治疗IBS的机制研究是观察个别炎症因子或炎症通路，对脑-肠轴机制研究较少，且缺乏将脑-肠轴与炎症通路相联系来分析艾灸抗炎的作用机制。本研究拟观察艾灸对IBS-D大鼠海马和结肠组织中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)的影响，探讨艾灸治疗IBS-D的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物与分组 健康清洁级雄性SD大鼠24只，体质量为200～250 g，购自安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号为SCXK(皖)2017-0001]。动物在安徽中医药大学实验动物中心饲养，饲养条件为Ⅱ级，光照周期12 h/12 h，室温为22～25 ℃，相对湿度为45%～60%，自由进食、饮水。在整个实验过程中，对动物的处置遵循中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试药及仪器 直径0.5 cm细艾条(批号 2018-10-06)：南阳宛北艾绒厂；IKKβ抗体(批号 AF03043503)：北京博奥森生物技术有限公司；IKBα抗体(批号 GR275907-37)：英国 Abcam；NF-κB 抗体(批号 9)：美国CST；ECL超敏发光试剂盒(批号 SF249607)：美国Thermo；番泻叶购自安徽中医药大学第二附属医院，由安徽中医药大学第二附属医院中药制剂室提供制剂。

电泳仪(型号 EPS300)、转膜仪(型号 VE-186)：上海天能科技有限公司；微量移液器(型号 P10)：德国Eppendorf；自动曝光仪(型号JS-1070P)：上海培清科技有限公司；全自动数字切片扫描系统Pannoramic MIDI：匈牙利3DHISTECH。

2 方法

2.1 模型复制与分组 采用慢性束缚联合番泻叶灌胃方法复制IBS-D模型。24只SD大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、艾灸组，每组8只。将番泻叶置入100 ℃沸水中浸泡30 min，并经双层纱布过滤，最后将滤液减压浓缩成生药含量为0.45 g/mL，在-4 ℃冰箱保存备用。除空白组外，其余两组大鼠进行番泻叶灌胃(0.45 g/mL，10 mL/kg)，灌胃后，用粗制棉绳束缚大鼠双后肢，限制其活动，放入饲养箱中，每日1 h。空白组大鼠仅予等容积蒸馏水灌胃，连续14 d。在模型复制结束后第1天，观察大鼠大便情况、直肠扩张(colorectal distension，CRD)和腹部回缩反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)。若模型组和艾灸组大鼠稀便率升高至少50%、AWR的最小容量阈值降低至少1 mL，且与空白组差异有统计学意义，则表明模型复制成功。

2.2 治疗方法 模型复制成功后，艾灸组大鼠取双侧“上巨虚”“天枢”[16]。将艾灸组大鼠置于特制大鼠艾灸架上，将直径0.5 cm的细艾条固定于艾灸支架上，悬于穴位上空约2 cm，每日1次，每次每穴灸30 min，共7次。空白组和模型组不做任何处理。

2.3 观察指标和方法

2.3.1 稀便率的计算 在治疗结束后第1天，观察6 h内各组大鼠的稀便率。稀便率=稀便数/总排便粒数×100%。干便、稀便的区分以滤纸上有无污迹为标准。

2.3.2 内脏敏感性评估(CRD所引起AWR的最小容量阈值测定) 稀便率检测结束后，对各组大鼠CRD诱发刺激下的AWR进行容量阈值测定。测定前，各组大鼠禁食不禁水12 h。对大鼠进行轻度麻醉后，甘油润滑8F的导尿管，将导尿管缓慢插入肛门，将大鼠置于透明塑料盒中，待大鼠完全苏醒后约20 min，经球囊注入26～28 ℃的生理盐水，观察引起大鼠AWR的最小容量阈值，重复3次，取3次均值作为该大鼠CRD引起AWR的最小容量阈值。

2.3.3 Western-blot法检测大鼠海马和结肠组织中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)蛋白表达 各组大鼠结肠组织采用匀浆方法提取其中蛋白，经过电泳，在转膜装置恒流转膜，IKKβ转膜85 min；IKBα转膜35 min；NF-κB(p65)转膜65 min。加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭2 h。按照合适的比例用一抗稀释液进行稀释(IKKβ抗体属性为兔抗1∶300稀释；IKBα抗体属性为兔抗1∶10 000稀释；NF-κB(p65)抗体属性为兔抗1∶1 000稀释)，4 ℃缓慢摇动孵育过夜。按照1∶20 000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，最后用ECL发光试剂蛋白检测。用自动曝光机曝光显影，用 Image J软件进行胶片条带的分析，以β-actin为内参蛋白，目的蛋白与β-actin的比值为其相对表达水平。

3 结果

3.1 各组大鼠AWR的最小容量阈值和稀便率比较 与空白组比较，模型组大鼠AWR的最小容量阈值显著下降(P<0.05)，稀便率显著升高(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组大鼠AWR的最小容量阈值显著升高(P<0.05)，稀便率显著下降(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠AWR的最小容量阈值和稀便率比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 各组大鼠海马和结肠中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白相对表达水平比较 与空白组比较，模型组大鼠海马和结肠中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组大鼠海马和结肠中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。见表2、图1。

表2 各组大鼠海马和结肠中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白相对表达水平比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：A.空白组；B.模型组；C.艾灸组

图1 各组大鼠海马和结肠组织中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白电泳图

4 讨论

IBS是现代社会常见的肠病之一，其中又以IBS-D多见，其发病机制比较复杂，肠道黏膜低度炎症、脑-肠轴相互作用可能起到至关重要的作用。随着对NF-κB结构与功能研究的深入，发现NF-κB信号传导途径的激活是肠道炎症发病的关键环节。NF-κB信号通路中3个关键因子依次为IKKβ、IKBα和NF-κB[17]。NF-κB通常指P50/P65(ReLA)的二聚体。当细胞接受外界刺激后，可激活IKKβ，IKKβ催化IKBα的N-末端丝氨酸磷酸化，导致IKBα泛素化并降解，则NF-κB游离，向细胞核内转移，核内的NF-κB增多，启动了炎症反应和下游通路[15]。本研究发现IBS-D大鼠海马和结肠组织中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白表达水平升高，艾灸治疗后，IBS-D大鼠稀便率降低、AWR的最小容量阈值升高，海马和结肠组织中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白表达水平降低，提示艾灸通过抑制IKKβ/IKBα/NF-κB信号通路的作用改善炎症反应。

脑-肠轴是指胃肠道和大脑间相互作用的双向调节系统，其有机地把胃肠功能和脑功能联系起来，是维持肠道正常生理功能的基础，肠道疾病的治疗可通过脑-肠轴起作用[18-19]。肠道黏膜损伤或发生炎症后，可引起多种化学递质的释放，支配胃肠道的内脏初级传入神经纤维自发活动增强，使中枢从外周获得的伤害感受增加，同时表现为感觉阈值降低。脑的各级中枢接受内外环境变化时传入的各种信息，经过整合，将其调控信息传送到肠神经系统或直接作用于胃肠效应细胞[19-20]。功能磁共振成像显示IBS患者存在脑部功能的变化，大脑皮质的活动性与内脏感觉以及症状呈现同步改变的现象，且目前IBS患者中，海马功能的紊乱已是很多研究达成的共识[21]。在进行CRD时，IBS患者额前皮质、右脑岛皮质、右侧丘脑的激活面积和磁共振信号强度变化显著增大[22]。

本研究发现，IBS-D大鼠海马和结肠组织中IKKβ、IKBα、NF-κB(p65)蛋白表达水平明显升高。艾灸治疗后，IBS-D大鼠海马和结肠组织中IKKβ、IKBα和NF-κB(p65)蛋白表达水平明显降低，提示艾灸通过抑制海马与结肠组织IKKβ/IKBα/NF-κB信号通路改善炎症反应，且艾灸治疗IBS-D可能是通过脑-肠轴途径实现的。

根据IBS-D的主要临床表现，其可归属为“泄泻”“腹痛”范畴。中医认为本病多因为先天禀赋不足和(或)后天失养、情志失调、饮食不节、感受外邪等而发，其病位在肠，涉及肝脾胃等脏腑。艾灸具有温阳通脉、活血化瘀、舒经活络之功效。天枢穴乃大肠募穴，是升清降浊之枢纽，能调节人体气机的升降，起到利湿止泻的功效。上巨虚作为大肠下合穴，对六腑疾病有特殊治疗作用，《针灸甲乙经》记载“飧泄大肠痛，巨虚上廉主之”，多用于治疗肠腑病证。上巨虚与天枢合募配伍，补益脾气，通降肠腑气机，升清降浊，止泻止痛。

综上，艾灸“天枢”“上巨虚”改善IBS-D大鼠腹泻症状和内脏高敏感性，可能与艾灸抑制IKKβ/IKBα/NF-κB信号通路有关，且可能是通过脑-肠轴起作用的，但具体作用机制尚未明确，还需进一步研究。