新藤黄酸抑制人肝癌细胞BEL-7402自噬作用研究

展 凡，王玉涵， 王 萌，郑 凤，苏婧婧，程 卉，李庆林

(安徽中医药大学科研实验中心 新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居肿瘤中第3位[1]。手术切除、肝移植是HCC主要的治疗方法[2]，但预后不良导致的HCC患者5年生存率低于5%[3]。越来越多的研究表明，自噬与HCC的危险因素相关，如氧化应激、代谢功能障碍、肝酒精紊乱和脂肪肝疾病[4-5]。细胞自噬是由基因调控并在进化上保守的细胞内降解通路。在自噬过程中，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，其可降解细胞质中受损、变形的大分子物质和细胞器，并将降解产物循环利用，从而为细胞的正常生存、代谢提供原料[6]。自噬作为抗肿瘤药物治疗的潜在作用靶点近年来已得到确认。但中药活性成分新藤黄酸(gambogenic acid，GNA)对人肝癌细胞BEL-7402自噬的影响尚不清楚。本研究通过体外试验，初步探讨GNA抑制人肝癌细胞BEL-7402增殖的作用与自噬的关系。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器 CO2培养箱：日本SANYO公司；洁净工作台(SW-CJ1F)：江苏省苏净集团；倒置显微镜(Olympus CKX41)和倒置荧光显微镜(Olympus BX51)：日本Olympus公司；全自动多功能酶标仪(SpectraMax M2e)：美国MD公司；灭菌锅：上海申安医疗器械有限公司。

1.2 主要试剂和药品 GNA：陕西省宝鸡市辰光生物科技有限公司(纯度98%，批号HN045248198)；RPMI 1640培养基：美国Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；氯喹(Chloroquine ，CQ)(货号C6628)：Sigma公司；雷帕霉素(Rapamycin ，Rap)(货号53123-88-9)：Sigma公司；阿霉素(货号 25316-40-9)：Selleck公司；anti-beclin 1(批号3495T)、anti-LC3B(批号3868T)、anti-p62 (批号8025T)和anti-actin (批号3700T)：美国CST公司。

2 方法

2.1 细胞活力和药物敏感性检测 将对数生长期的细胞按照5×103/mL接种于96孔板。设立空白对照组(0 μmol/L GNA)和不同浓度给药组，每组设6个复孔。待细胞贴壁良好，弃培养基，每孔分别加入0、2、4、8、16 μmol/L的GNA溶液100 μL，放置37 ℃，5% CO2的培养箱24、48、72 h后弃去培养基，在终止培养前4 h每孔加入MTT培养液20 μL继续孵育。孵育终止弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，摇床上避光振荡10 min后用酶标仪在570 nm波长处测每孔的光密度(optical density，OD)值，按照上述过程，重复3次，计算细胞存活率。

2.2 单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色荧光显微镜观察自噬体的形成 将对数生长期的细胞以每孔3×105个接种于6孔板，待细胞生长良好，按照实验要求分为空白对照组、Rap组(50 μmol/L)和GNA(1.5、3、6 μmol/L)给药组。细胞培养24 h，收集对照组和给药组细胞，PBS洗2遍，用1 mL PBS重悬，加入1 μL MDC储存液(浓度为50 mmol/L)，使MDC的终浓度为0.05 mmol/L。37 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤3遍。吸取微量细胞悬液滴于玻片，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察自噬小体。

2.3 透射电子显微镜观察自噬体水平 按照试验要求设立空白对照组、Rap组(50 μmol/L)和GNA(1.5、3、6 μmol/L)给药组。细胞培养24 h，收集细胞，离心使细胞沉淀成团，将戊二醛沿着管壁缓慢加入用于固定细胞，放入4 ℃冰箱。次日用PBS洗涤细胞3遍，每次5 min；再用锇酸于4 ℃固定1.5 h，PBS洗3次，每次5 min；按以下步骤脱水：50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，90%乙醇10 min，100%乙醇10 min，100%丙酮10 min 2次；环氧树脂包埋过夜；再放入45 ℃烘箱内固化12 h；切片后用醋酸铀和枸橼酸铅染色，在透射电子显微镜下观察细胞的超微结构。

2.4 Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、p62、beclin 1的表达情况 将对数生长期的细胞按照每孔5×106个接种于6孔板，待细胞生长良好，按照试验要求分为空白对照组、Rap组(50 μmol/L)和GNA(1.5、3、6 μmol/L)给药组以及CQ组(10 μmol/L)，细胞培养24 h。提取各组总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白质浓度。蛋白上样量定为20 μg。进行SDS-PAGE电泳，结束后将蛋白转至NC膜，在5%脱脂奶粉封闭液中封闭2 h，弃封闭液并洗膜。加入对应的一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，摇床慢摇2 h，洗膜后曝光处理。并计算目标蛋白与内参蛋白(β-actin)条带灰度比值，以此来确定各组蛋白的相对表达量。以上实验重复3次。

3 结果

3.1 GNA对人肝癌细胞BEL-7402存活率的影响 不同浓度的GNA作用于BEL-7402细胞24、48、72 h后，BEL-7402细胞存活率随时间和剂量依赖性降低，IC50分别为6.408、4.077、3.001 μmol/L。见图1。

注：与空白对照组比较，*P<0.05

3.2 GNA对人肝癌细胞BEL-7402形态的影响 空白对照组细胞贴壁生长，细胞数目较多且排列紧密，胞质均匀透明；Rap组细胞贴壁生长较少，细胞脱落、悬浮增加，形状不一，细胞碎片化；不同浓度GNA组，随药物浓度增加，细胞贴壁数量减少，排列不紧密，细胞悬浮增加，高浓度GNA组出现细胞碎片化。见图2。

注:A.空白对照组;B.Rap组;C.GNA1.5μmol/L组;D.GNA3μmol/L组;E.GNA6μmol/L组

图2 倒置显微镜下观察GNA对人肝癌细胞BEL-7402形态的影响(10×40倍)

3.3 GNA对人肝癌细胞BEL-7402自噬小体形成的影响 荧光显微镜观察发现，空白对照组荧光强度较弱，自噬小体的数量较少；自噬诱导剂Rap组自噬小体数目较多；随GNA浓度增加，荧光强度增加即自噬小体增多。见图3。

注:A.空白对照组;B.Rap组;C.GNA1.5μmol/L组;D.GNA3μmol/L组;E.GNA6μmol/L组

图3 GNA对人肝癌细胞BEL-7402细胞自噬小体形成的影响(MDC染色，10×40倍)

3.4 GNA对人肝癌细胞BEL-7402自噬小体水平的影响 透射电子显微镜观察细胞自噬小体，空白对照组细胞形态正常，结构清晰，偶见少量自噬小泡；Rap组细胞浆中出现大量自噬空泡聚集；随GNA浓度的增加，自噬泡数目增多，堆积明显。图中箭头所指均为自噬小体。见图4。

注:A.空白对照组;B.Rap组;C.GNA1.5μmol/L组;D.GNA3μmol/L组;E.GNA6μmol/L组

图4 透射电子显微镜观察GNA对人肝癌细胞BEL-7402自噬小体水平的影响(1×20 000倍)

3.5 GNA对人肝癌细胞BEL-7402自噬相关蛋白表达的影响 不同浓度(1.5、3、6 μmol/L)GNA作用细胞24 h后，随药物浓度的增加，Beclin1、p62和LC3-Ⅱ蛋白表达水平均显著增加(P<0.05)，LC3-Ⅰ蛋白水平无明显变化；Rap组各自噬相关蛋白的表达说明Rap可诱导人肝癌BEL-7402细胞发生自噬(见图5Ⅰ)。单独加入10 μmol/L CQ可降低Beclin1蛋白表达，增加LC3-Ⅱ蛋白表达以及p62蛋白的积累，结果提示GNA对人肝癌BEL-7402细胞自噬的影响可能与其抑制自噬后期进程有关(见图5Ⅱ)。

注：A.空白对照组；B.Rap组；C.GNA 1.5 μmol/L组；D.GNA 3 μmol/L组；E.GNA 6 μmol/L组；F.10 μmol/L CQ组；与空白对照组比较，*P<0.05

4 讨论

近年来，自噬被认为与癌症的发生和发展有关，当肿瘤细胞处于饥饿、化学治疗、低氧等应激情况时，肿瘤细胞内自噬水平升高，为肿瘤细胞生存提供必须的营养和能量，肿瘤细胞存活能力增强。越来越多的研究表明，中药有效成分可通过调控肿瘤细胞自噬水平来抵抗癌症，增加癌症治疗的可能性[7-8]。

中药藤黄系藤黄科植物分泌的干燥树脂[9]，黄棕色，呈不规则块状。1984年吕归宝从藤黄中分离得到GNA，其具有良好的抗肿瘤作用。近年来，本课题组对GNA的系列研究发现，GNA能够抑制多种肿瘤细胞增殖，其抗肿瘤作用与调控线粒体氧化应激、调节细胞周期、诱导细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞保护性自噬有关[10-14]。本研究表明，GNA在一定剂量范围呈时间和剂量依赖性抑制BEL-7402细胞增殖。GNA处理后，MDC染色荧光显微镜观察和透射电子显微镜观察结果均显示，细胞内自噬小体堆积。同时，Western blot检测结果表明，自噬上游蛋白Beclin1的表达增加，提示自噬被激活；LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变增加，也提示自噬小体数量的增多。但是这些证据并不能特异性反映自噬水平的增加，如果自噬进程后期溶酶体功能受到抑制，也可能导致自噬体堆积，LC3-Ⅱ含量积累。值得一提的是，笔者发现LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变的同时，LC3-Ⅰ的含量并没有显著变化，因此推测，GNA诱导的自噬可能并不是完整过程的自噬。此外，自噬溶酶体降解底物p62的表达增加，p62的总细胞蛋白表达水平与自噬水平呈反相关。因此笔者认为，GNA可能有阻断BEL-7402细胞自噬后期进程中溶酶体的功能。加入自噬溶酶体抑制剂CQ处理后结果显示，CQ对LC3和p62蛋白的调节作用与GNA一致，进一步证实了GNA可能部分通过抑制自噬促进肿瘤细胞死亡的猜测。但是GNA的这种抑制自噬促进细胞死亡的信号途径有待于进一步的研究。