阳和平喘颗粒通过TGF-β1/Smad信号通路影响慢性哮喘大鼠气道重塑的机制

徐晴雯，任冯春，李 敏，朱慧志，刘向国，刘 璐

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)

哮喘是一种涉及多种炎症细胞，以慢性气道炎症为特征的异质性疾病[1]，其主要病理特点是气道炎症、气道重塑和气道高反应[2]。气道重塑是长期慢性炎症引起的气道结构的改变，其特征是上皮下纤维化、气道壁增厚、平滑肌质量增加、新生血管生成和黏液腺增多[3]。转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)/Smad信号通路是近年来发现的与气道重塑相关的重要机制之一[4-5]。本研究通过复制哮喘大鼠模型，观察阳和平喘颗粒对哮喘气道炎症及气道重塑的影响并探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物与分组 SPF级SD大鼠50只，雄性，6～8周龄，体质量(200±20)g，购自安徽医科大学实验动物管理中心[生产许可证号：SCXK(皖)2011-0003]，饲养于安徽中医药大学实验动物中心。适应性喂养1周后采用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、地塞米松组、阳和平喘颗粒低剂量组、阳和平喘颗粒高剂量组，每组10只。

1.2 药物与试剂 卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)(批号A5253)：美国Sigma公司；阳和平喘颗粒(药物组成为麻黄、五味子、葶苈子、巴戟天、熟地黄、白芥子、旋覆花、当归等，每包10 g，每克含生药量2.7 g；批号 20120511)：安徽中医药大学第一附属医院制剂中心；醋酸地塞米松片(每片0.75 mg；批号 111110)：浙江仙琚制药股份有限公司；白细胞介素4(interleukin 4, IL-4)ELISA试剂盒(批号E-30645)、白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)ELISA试剂盒(批号E-30644)：上海源叶生物科技有限公司；兔抗Smad2(批号B58028)、兔抗Smad3(批号B58031)、兔抗TGF-β1(批号G58011)：安诺伦(北京)生物科技有限公司。

1.3 仪器 鱼跃503AI型超声雾化器：江苏鱼跃集团；雾化箱(130 cm×80 cm×75 cm)：自制；BX-Ⅸ型生物组织包埋机：孝感市宏业医用仪器有限公司；EPS-300 型电泳仪：上海天能科技有限公司； BX51型光学显微镜：日本OLYMPUS公司；DM4000B型图像采集系统：德国Leeia公司。

2 方法

2.1 动物模型复制 根据刘中成等[6]的方法并加以改进复制大鼠慢性哮喘模型。致敏：模型组、地塞米松组、阳和平喘颗粒低剂量组和阳和平喘颗粒高剂量组在实验的第1天和第8天分多点腹腔注射致敏液(OVA 1 mg +氢氧化铝凝胶100 mg +生理盐水1 mL)；正常组注射等量生理盐水。激发：实验第15天开始将大鼠放入雾化箱中，予以1% OVA溶液雾化，每周3次，每次30 min，连续6周；正常组予以等量生理盐水。大鼠出现喘息、喷嚏、呼吸急促、烦躁不安、站立不稳等症状则为激发成功。

2.2 药物干预 将阳和平喘颗粒加生理盐水溶解配制成0.175 g/mL和0.7 g/mL的混悬液，将醋酸地塞米松片碾碎后加生理盐水配制成0.008 75 mg/mL的混悬液。根据体表面积法进行折算，于实验第15天开始，阳和平喘颗粒低剂量组和阳和平喘颗粒高剂量组每日分别予以阳和平喘颗粒1.75、7 g/kg灌胃，其用药量分别相当于临床用量的3.5倍和14倍；地塞米松组每日予以地塞米松0.087 5 mg/kg灌胃，其用药量相当于临床用量的7倍。正常组和模型组每日分别给予生理盐水10 mL/kg灌胃。各组均持续灌胃6周。

2.3 指标检测

2.3.1 苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察支气管肺组织形态学改变 采用HE染色，在显微镜下观察分析各组大鼠支气管肺组织的病理改变。

2.3.2 ELISA法检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IL-4和IL-6的水平 取各组大鼠BALF，离心取上清，参照ELISA试剂盒说明书的步骤，检测BALF中IL-4和IL-6的水平。

2.3.3 Western blot法检测支气管肺组织中TGF-β1、Smad2与Smad3蛋白表达 提取大鼠左肺组织蛋白，按照试剂盒要求，按步骤完成上样，电泳，转膜，封闭抗体，孵育一抗、二抗，彻底洗涤后经增敏化学发光法显色，加入底物与反应液后，显色5 min。用IPP软件对图像目的条带进行灰度分析，以与内参照β-actin产物条带的比值作为相对表达水平。

3 结果

3.1 各组大鼠支气管肺组织形态学改变 镜下可见正常组大鼠支气管肺组织结构清晰完整，无炎症细胞浸润；与正常组比较，模型组大鼠支气管管腔变窄，平滑肌层及基底膜层增厚，周围可见炎症细胞浸润；与模型组比较，阳和平喘颗粒低剂量组、阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组大鼠支气管管腔接近正常，平滑肌层及基底膜层增厚减轻，炎症细胞浸润较少；与阳和平喘颗粒低剂量组比较，阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组改善更加明显。见图1。

图1 各组大鼠支气管肺组织病理学改变(HE染色，10×20倍)

3.2 各组大鼠BALF中IL-4和IL-6水平比较 与正常组比较，模型组BALF中IL-4和IL-6水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组BALF中IL-4和IL-6水平均显著降低(P<0.05)；阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组BALF中IL-4和IL-6水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠BALF中IL-4和IL-6水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与地塞米松组比较，△P<0.05；与阳和平喘颗粒低剂量组比较，◇P<0.05

3.3 各组大鼠支气管肺组织中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相对表达水平比较 与正常组比较，模型组肺组织中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相对表达水平明显上升(P<0.05)；与模型组比较，阳和平喘颗粒低剂量组、阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组肺组织中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相对表达水平显著下降(P<0.05)；与阳和平喘颗粒低剂量组比较，阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组肺组织中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相对表达水平显著下降(P<0.05)。见图2、表2。

注：A.正常组；B.模型组；C.阳和平喘颗粒低剂量组；D.阳和平喘颗粒高剂量组；E.地塞米松组

图2 Western blot法检测各组大鼠肺组织中TGF-β1、

Smad2、Smad3蛋白相对表达水平

4 讨论

中医将哮喘归为“哮病”范畴，认为该病多因痰饮留伏，结成窠臼，潜伏于内，复感外邪，引动内痰，痰阻于肺，肺失宣肃，故上气而喘，痰鸣如吼，发为哮病。哮病日久，肺脾肾三脏皆损。该病病性属本虚标实，故治疗多以补肾、化痰、活血调营为主。阳和平喘颗粒是安徽中医药大学第一附属医院研发的院内制剂，系胡翘武临床经验方[7]，由《椿田医话》阳和饮化裁而来，临床已有数十年应用历史。全方组成为麻黄、五味子、葶苈子、巴戟天、熟地黄、白芥子、旋覆花、当归等药。方中以麻黄宣肺平喘，利水消肿；五味子、巴戟天、熟地黄温补肾阳，纳气平喘；旋覆花、白芥子、葶苈子温肺化饮、利气消痰；当归养血活血，祛瘀平喘。诸药合用，共同达到温肾宣肺、化痰降气、活血调营的功效。前期临床研究[8]表明，阳和平喘颗粒可以改善肺功能，减轻气道炎症，进而缓解患者的临床症状。前期动物研究[9-10]表明，阳和平喘颗粒可以降低炎症因子表达水平，抑制杯状细胞增生，减轻气道黏液高分泌，从而减轻气道炎症及延缓气管重构，对哮喘大鼠有确切的治疗作用。

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白相对表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与地塞米松组比较，△P<0.05；与阳和平喘颗粒低剂量组比较，◇P<0.05

现代医学认为，Th1/Th2失衡是哮喘发病的原因，Th2细胞因子在哮喘发病中起着重要作用[11]。Th2亚群主要分泌IL-4、IL-6、IL-13等细胞因子，IL-4激活B细胞促进分泌产生IgE[12]。而IL-6作为重要炎症递质,对急性蛋白及免疫球蛋白E生成有促进作用[13]。另有研究证实，IL-4作为炎性细胞因子可以与TGF-β共同作用[14]，诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞分泌大量细胞外基质并沉积[15]。IL-6可诱导TGF-β信号传导[16]，刺激肌纤维母细胞增殖后促进上皮下纤维化的形成，增加气道上皮下胶原蛋白沉积和基底膜厚度[17]。

TGF-β1/Smad信号通路参与气道重塑过程，TGF-β1表达与气道基底膜厚度、成纤维细胞数目呈正相关，与哮喘发作的严重程度也有正相关性[18]。研究表明，哮喘大鼠肺组织中TGF-β1水平升高[19]。Smad蛋白作为TGF-β信号转导系统的重要成员，直接从细胞膜向细胞核传递信号，介导细胞内TGF-β信号转导，调控细胞增殖、转化、合成、分泌和凋亡[20]。其中Smad2、Smad3为受体调节型蛋白，直接参与信号转导，起正调节作用，促进纤维母细胞向纤维细胞转化，促进气道肌成纤维细胞增殖。Smad2、Smad3磷酸化后刺激TGF-β1产生Ⅰ型胶原蛋白，并且TGF-β1使成纤维细胞分化成肌成纤维细胞[21]。肌成纤维细胞增殖，胶原沉积增多，气道壁增厚，黏液腺增多等改变最终使伤痕组织取代了正常的肺组织，使气体交换面积减少，最终导致呼吸能力下降。

本研究发现，与正常组比较，模型组大鼠支气管肺组织病理改变明显，气管壁及周围炎症细胞浸润程度增加，BALF中IL-4、IL-6水平均明显升高，提示模型组大鼠存在慢性炎症，模型复制成功；而与模型组比较，各治疗组大鼠支气管肺组织病理改变减轻。阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组BALF中IL-4、IL-6水平较阳和平喘颗粒低剂量组下降更明显，阳和平喘颗粒高剂量组与地塞米松组结果相似。结果提示阳和平喘颗粒可以减轻气道炎症，与课题组前期研究一致。模型组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2和Smad3较正常组明显增加；各治疗组肺组织TGF-β1、Smad2和Smad3均有所下降，而阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组较阳和平喘颗粒低剂量组下降更明显，阳和平喘颗粒高剂量组与地塞米松组结果相似。结果提示阳和平喘颗粒可以减轻气道重塑，这可能与其下调TGF-β1/Smad信号通路有关。

综上所述，本研究表明阳和平喘颗粒可以改善哮喘气道重塑，减轻气道炎症，其机制可能与调节TGF-β1/Smad信号通路有关。