CCL23-CCR1趋化因子轴在上皮性卵巢癌疾病进展中的作用

冯星浩，颜士杰，肖 兰，魏兆莲

卵巢癌(ovarian cancer，OC)最常见类型是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)。目前，肿瘤细胞减灭术及铂类联合紫杉醇的系统化疗是卵巢癌国内外规范化治疗的一线方案。因发病隐匿，70% EOC就诊时已属晚期，且易出现化疗耐药或复发。该研究通过抗体芯片，筛选出骨髓祖细胞抑制因子(myeloid progenitor inhibitory factor 1,MPIF-1)作为本研究的目的蛋白。MPIF-1又叫CCL23。研究表明外周血单核细胞中CCL23的表达水平与癌症患者的进展和存活相关，并通过构建小鼠模型发现CCL23促进肿瘤细胞在转移前器官中的存活，有助于乳腺癌细胞肺部转移集落的形成[1]。为明确CCL23在上皮性卵巢癌发生发展中的功能，该研究采用ELISA、免疫组化及qRT-PCR方法检测上皮性卵巢癌患者血清CCL23浓度及原位病灶组织中的CCL23基因和蛋白表达水平。

1 材料与方法

1.1 病例资料调取安徽医科大学第一附属医院病理科2010年1月-2015年1月首次诊断为上皮性卵巢癌患者的石蜡切片，根据2014年国际妇产科联盟卵巢癌分期标准(FIGO)进行病理分期，选取其中Ⅰ期20例，Ⅱ期20例，Ⅲ期40例，Ⅳ期20例，术前未接受新辅助化疗或免疫治疗，另取正常卵巢组织10例，浆液性卵巢瘤及交界性卵巢瘤，各20例，作为对照，其中正常卵巢组织来源于围绝经期因“子宫肌瘤”行子宫及双侧附件切除术的患者。

1.2 组织保存采用RNaFixer无液氮RNA样品储存液保存卵巢组织。组织标本入组标准：于该院首次诊断为上皮性卵巢癌患者，术前未接受新辅助化疗或免疫治疗，于手术日待手术标本取下，使用PBS冲洗组织3次，洗去组织上的血液，迅速将新鲜组织剪成长、宽、高任意一边厚度<0.5 cm浸泡入RNaFixer，新鲜组织浸泡于5倍体积的RNaFixer中，4 ℃过夜，后转移至-20 ℃长期保存。样品使用时可以在室温融化，研磨匀浆进行下一步RNA提取。

1.3 试剂TRIzol试剂购自美国InvitroGen公司；RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；RNaFixer无液氮RNA样品储存液购自北京普鲁顿生物科技有限公司；ELISA试剂盒购自美国MyBioSource公司；通用型SP9000试剂盒购自福建迈新公司；细胞因子抗体芯片检测试剂盒购自美国RayBiotech公司；化学发光法检测试剂盒购自英国Amersham Phaimacia生物科技有限公司。

1.4 抗体芯片技术抗体蛋白质检测结果见图1，操作过程按试剂盒说明书进行并略作修饰。具体步骤为：将已包被抗体的蛋白质芯片膜包被于BSA缓冲液室温孵育30 min，以阻断非特异性反应，然后将膜与培养液于摇床上室温孵育4 h,缓慢摇动，使反应均匀，充分洗膜，洗去非特异性结合物，加2 ml生物素结合的抗体，4 ℃孵育过夜，再次彻底洗膜，加辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素，室温孵育4 h，充分洗膜，使用化学发光法检测试剂盒和UVP化学信号图像系统显色，照相，使用Ray Biotech INC抗体芯片分析工具软件对所有原始数据(光点密度)根据单个膜阳性与阴性对照值进行标准化处理及减除背景处理，再进行组间比较。

1.5ELISA采用ELISA检测血清中CCL23的浓度。于手术日早晨取患者空腹血于抗凝管中，室温静置30 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清液于无酶EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存，行ELISA前置于冰上解冻，涡旋混匀。标准孔中加入50 μl标准品，实验孔中加入10 μl血清样本及40 μl样本稀释液毎孔中加入100 μl HRP试剂，37 ℃温箱中孵育1 h，wash buffer清洗孔4次洗去非特异性结合，分别向毎孔中加入50 μl A显色液和50 μl B显色液，37 ℃温箱中孵育15 min，毎孔中分别加入50 μl终止液，酶标仪上立即测定450 nm处吸光度值。根据标准孔的吸光度值建立标准曲线，计算实验孔对应血清CCL23浓度。

1.6 实时荧光定量PCRTRIzol冰上裂解组织5 min，待组织及细胞充分溶解，加入200 μl氯仿，上下振摇EP管，冰上放置3 min后，4 ℃、7 500 r/min离心15 min后，取上层水相转移至另一个EP管中，加入500 μl异丙醇，充分混匀，冰上放置10 min,4 ℃、7 500 r/min离心10 min,去上清液，加入含DEPC的70%乙醇1 ml混匀洗涤后，4 ℃、3 125 r/min 离心10 min,重复洗涤3次，用DEPC水溶解RNA沉淀，立即测定RNA浓度和纯度，将提取的RNA逆转录(RT)合成cDNA等操作方法均严格遵照试剂盒说明书进行。CCL23基因引物序列(5′-3′)，上游：GCTGACTGCTGCATCTCCTACAC；下游：GGCTTGGAGCACTCGCTGTTC。内参18S基因的引物序列(5′-3′)，上游：CATCTTCTTTTGCGTCGCCA；下游：TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC。PCR反应体系为20 μl，反应条件95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40次循环。每个样品均设3个复孔，采用2-ΔΔct计算各目的基因mRNA的表达水平，其中Ct值为循环阈值。

1.7 免疫组化石蜡切片采用免疫组化SP法检测蛋白表达水平。组织标本切片置于65 ℃烤箱中烘烤1 h后，立即置于二甲苯中15 min，梯度乙醇脱水，PBS浸洗3次，室温条件下0.3% Triton X-100通透30 min，行改良柠檬酸盐修复液高压修复20 min，待冷却至室温，使用3%过氧化物酶阻断剂37 ℃封闭30 min，PBS浸洗3次，山羊血清37 ℃封闭1 h，轻轻甩去血清，一抗CCR1按1 ∶50稀释，阴性对照采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，4 ℃过夜，PBS浸洗3次，二抗37 ℃孵育30 min后，PBS浸洗3次，三抗37 ℃孵育30 min，后DAB显色，结果判定标准本研究组中组织标本切片SP法检测结果均有两名本院资深病理科医师阅片后判定。以细胞膜或细胞质出现黄色或者棕褐色颗粒者为阳性细胞，根据每份标本中的阳性细胞所和染色强度所占百分比进行评分及分组。CCR1丰度的半定量采用Image Pro Plus 6.0进行平均光密度值分析。按照癌细胞阳性细胞占比分为四个等级，其中高表达(癌细胞阳性表达占比>80%)；中度表达(癌细胞阳性表达占比40%～80%)；低表达(癌细胞阳性表达<40%)及阴性表达组。

2 结果

2.1 对照组和上皮性卵巢癌患者组血清中CCL23的浓度课题组前期通过对比4例成年正常女性血清和6例上皮性卵巢癌患者血清中441 种炎性因子表达水平，筛选出趋化因子CCL23差异表达；并进一步在22例正常成年女性及36例上皮性卵巢癌患者血清中进行验证，22例成年正常女性年龄40～63(53.80±8.20)岁，血清CCL23表达水平(1 157.80±457.40)pg/ml，36例上皮性卵巢癌患者年龄43～65(54.00±10.80)岁，血清CCL23表达水平(1 654.90±849.00)pg/ml。实验组患者年龄略高于正常对照组年龄，差异无统计学意义(t=0.095,P=0.925)。实验组血清CCL23水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义(t=-2.443，P=0.018 8)，见图1。

2.2 对照组和上皮性卵巢癌患者组原位病灶中CCL23及CCR1的表达6例成年正常女性卵巢上皮组织中CCL23 mRNA表达水平(1.70±0.45)，6例上皮性卵巢癌患者原位病灶组织中CCL23 mRNA表达水平(12.99±2.88)，差异有统计学意义(t=-7.515,P=0.006)。此外，课题组通过免疫组化法证明CCR1在正常卵巢生发上皮(ovarian surface epithelial, OSE)呈阴性表达，见图2。经过光密度分析，在Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌石蜡切片中CCR1阳性表达较Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌表达升高，差异有统计学意义(t=-4.403,P=0.000 6)。其中Ⅲ/Ⅳ期上皮性卵巢癌共60例，平均光密度值(1.77±0.15)，Ⅰ/Ⅱ期共40例，平均光密度值(0.85±0.13)，见图3。

图1 趋化因子CCL23抗体芯片检查结果1～4：正常对照组；5～10：上皮性卵巢癌组患者

3 讨论

趋化因子家族是一个极其复杂的网络，促炎机制可用来有效解释排卵次数增多、子宫内膜异位症、接触滑石粉和石棉可增加卵巢癌患病风险。Trabert et al[2]在一项对前列腺癌、肺癌、结肠癌和卵巢癌的巢式病例对照研究中，通过比较149例卵巢癌患者血清和149例对照组血清发现，急性C反应蛋白、细胞因子IL-1α、IL-8、TNF-α，与卵巢癌患病风险呈正相关。血清趋化因子水平也可能成为恶性肿瘤的敏感预后指标之一。本课题组通过蛋白质芯片工具对比4例成年正常女性血清和6例上皮性卵巢癌患者血清中441种炎性因子表达水平，筛选出趋化因子CCL23差异表达。并进一步在22例成年正常女性及36例上皮性卵巢癌患者血清中进行验证，提示上皮性卵巢癌组患者血清CCL23浓度明显高于正常对照组，CCL23可能成为一种新的上皮性卵巢癌患者标志物。

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)和改善上皮性恶性肿瘤不良预后相关。Bronger et al[3]通过体外实验发现，CXCL9和CXCL10利于TILs在上皮性卵巢癌肿瘤内的募集，从而发挥TILs的抑癌功能。K Au et al[4]在ID8同系小鼠高级别浆液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer, HGSOC)模型中发现，CXCL10表达的增加可减少小鼠肿瘤负荷和恶性腹水量，而在ID8过表达CXCL10小鼠移植瘤模型中，腹水VEGF和IL-6水平明显降低，CXCL10在HGSC肿瘤微环境中起着积极的作用。Rainczuk et al[5]在135例浆液性卵巢癌患者临床样本中发现，HGSOC可以表达CXCL10的拮抗物，干扰肿瘤中TILs的募集，从而导致患者的不良预后。Dangaj et al[6]研究表明，实体肿瘤来源的CCL5和经髓细胞来源的IFN-γ诱导的CXCR3之间的相互作用，精细地调节TILs的浸润过程。本课题组目前实验结果提示上皮性卵巢癌病灶可能产生趋化因子，并且同时表达趋化因子受体，可能通过自分泌作用方式形成正反馈，从而直接参与肿瘤的发生及恶性生物学行为，但目前尚未建立可信的模型进行验证。

图2 免疫组化检测正常对照组、浆液性囊腺瘤组、交界性肿瘤组中CCR1的表达

A：正常对照组；1、2中箭头所示为正常OSE；1：200×视野图例；2、3：400×视野图例；B：浆液性囊腺瘤组；B2中箭头所示为纤维结缔组织内衬浆液性单层柱状上皮；C：交界性肿瘤组；C2中箭头所示见浆液性上皮复层化；3：HE染色

肿瘤微环境中的趋化因子表达谱可改变癌细胞的生物学行为，癌细胞能够响应趋化因子刺激。Ding et al[7]通过人群及体外细胞学实验研究表明，肿瘤相关巨噬细胞可以通过分泌CCL5，促进胃癌的发展和转移；越来越多的研究表明腹腔微环境与上皮性卵巢癌腹腔转移相关。Lane et al[8]等使用ELISA检测53例上皮性卵巢癌、24例卵巢良性肿瘤腹水，发现晚期浆液性卵巢癌腹水中CCL18水平明显升高，并在体外实验中发现癌性腹水和CCL18可以剂量依赖性的增加卵巢癌细胞系CaOV3和OVCAR3的转移能力。Peng et al[9]证实肿瘤相关间皮细胞(cancer associated mesothelial, TAM)具有促肿瘤活性，并通过体外实验证实纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)通过诱导CAM的形成，CAFs释放IL-8和CXCL5进一步促进卵巢癌细胞的转移。Zhao et al[10]通过免疫组化对比58例浆液性卵巢癌和25例卵巢正常上皮中CXCL14的表达，发现肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblast, CAF)中高表达CXCL14与患者不良预后相关，在体外实验中，CAF高表达CXCL14，可上调长连非编码RNA LINC00092, 从而促进卵巢癌的进展。该研究使用qRT-PCR方法发现上皮性卵巢癌患者组原位病灶组织中CCL23基因的表达水平明显增高，提示该基因可能参与调控上皮性卵巢癌的进展。为了解CCL23-CCR1在上皮性卵巢癌疾病进展中的作用，课题组使用免疫组化的方法，发现正常OSE中CCR1呈阴性表达，而上皮性卵巢癌原位病灶组织中CCR1呈阳性表达，并且CCR1在Ⅲ/Ⅳ期上皮性卵巢癌中的表达明显高于Ⅰ/Ⅱ期，提示CCL23-CCR1趋化因子轴可能在上皮性卵巢癌疾病进展中作用。但本研究并没有证明趋化因子CCL23直接作用于受体CCR1，从而促进上皮性卵巢癌的进展，这些需在后续实验中进一步证明。目前，关于CCL23基因过表达对上皮性卵巢癌的影响尚不明确，计划后续继续开展相应功能试验，并对上皮性卵巢癌患者对应网膜转移病灶中CCL23的表达进行相关检测，进一步证明CCL23/CCR1轴在上皮性卵巢癌网膜转移中的作用。

A：200×视野图例；B：400×视野图例；C：400×HE染色图例；1：Ⅰ期；2：Ⅱ期；3：Ⅲ期；4：Ⅳ期；D：各期别上皮性卵巢癌按照低、中、高表达分组后所占百分比图例；E：半定量分析Ⅲ/Ⅳ期组织中CCR1表达；与Ⅰ/Ⅱ期比较：*P<0.05

综上，趋化因子CCL23在上皮性卵巢癌患者和正常成年女性中存在差异表达，上皮性卵巢细胞可能通过自分泌作用形式形成正反馈，从而促进肿瘤细胞的存活。目前，CCL23基因作用机制的研究尚处于起始阶段，其参与上皮性卵巢癌的发生、发展的机制及作用有待于进一步探索。