生酮饮食对高原低氧环境下小鼠海马神经元损伤的保护作用

钟 婷，李 琴，白芙蓉，卿 羽，刘英海，古学东，吴 畏

我国高原地区地域辽阔，自然环境恶劣，其中低压、低氧、寒冷、辐射强等特点都对高原人群生命健康产生很大影响 。当从平原地区进入高原地区时，随着海拔升高，大气氧分压降低，机体摄入氧不足而导致组织缺氧，其中大脑对缺氧耐受能力最差，可造成不同程度的脑组织损伤，甚至造成认知、情绪及神经心理上的损伤，严重者可发生高原性脑水肿而危及生命[1]。因此寻找一种有效可行的干预方法保护高原低氧性脑损伤具有重要意义。生酮饮食是一种高脂肪、低碳水化合物饮食，最初是难治性癫痫的有效治疗手段。给予生酮饮食时，糖的来源受限，脂肪酸成为了人体的主要供能物质[2]，脂肪酸在肝脏代谢时产生的特殊产物——酮体，包括乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮，可以自由穿过血脑屏障，为脑组织提供必须的能量。该研究通过模拟高原低氧环境，观察生酮饮食预处理对高原低氧环境下小鼠海马神经元损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饮食雄性C57BL/6小鼠(8～9周，18～20 g)由成都达硕实验动物有限公司提供。小鼠随机分为常氧对照(NC)组、常氧生酮(NK)组、低氧对照(HC)组和低氧生酮(HK)组，每组11只。小鼠给予标准饮食(购买于成都达硕实验动物有限公司)或生酮饮食(每100 g食物中含脂肪67.2 g，蛋白质17.6 g，碳水化合物0.2 g，购买于美国Research Diets公司)，各组小鼠禁食过夜后分别接受上述饮食3周，实验期间小鼠自由饮水和摄食，饲养于常压常氧的饲养室中(成都海拔约500 m)，分笼饲养，饲养室温度控制在22～24 ℃，湿度控制在40%～50%。

1.2 实验主要试剂兔抗线粒体融合蛋白1(mitochondrial fusion protein 1, MFN1)、兔抗线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1, FIS1)(Protein tech)，鼠抗β- actin(Santa Cruz)；山羊抗兔荧光二抗、山羊抗鼠荧光二抗(CST)。

1.3 实验方法

1.3.1低氧环境的建立 采用低压氧舱(中国贵州风雷)，模拟海拔高度6 000 m，舱内温度22～24 ℃，舱内湿度40%～50%，运行时间为24 h/d，昼夜比12 h ∶12 h，持续6 d。HC组和HK组小鼠置于低压氧舱中，每天早上9点取出小鼠，更换水和食物，观察小鼠情况，30 min后继续放回低压氧舱。NC组和NK组置于舱外(成都海拔约500 m)饲养。

1.3.2取材与标本制作 持续低氧6 d后，每组随机选取4只小鼠，戊巴比妥钠腹腔麻醉后，4%多聚甲醛心内灌注固定后开颅，取出脑组织，放入固定液(10%福尔马林)中进行固定，常规石蜡包埋，连续切片，用于尼氏染色。每组随机选取4只小鼠断头处死，冰上快速分离海马，-80 ℃冰箱保存，用于Western blot实验。各组剩余小鼠断头处死，冰上快速分离脑组织，立即做Seahorse实验。

1.3.3尼氏染色 石蜡切片脱蜡至水，常规甲苯胺蓝染色，光学显微镜下观察小鼠海马组织CA1、CA3区、齿状回部位的病理学改变。

1.3.4蛋白印迹法(Western blot) 将加入细胞裂解液的海马组织在冰上匀浆，待其充分裂解后离心15 min，取上清液进行蛋白定量及蛋白样品制备。常规电泳、转膜(PVDF膜)、5%脱脂奶粉封闭，4 ℃孵育一抗过夜：兔抗MFN1 (1 ∶1 000)、兔抗FIS1(1 ∶1 000)，室温孵育二抗(1 ∶20 000)1 h，结果用LI-COR远红外成像系统扫描。

1.3.5Seahorse实验 提取新鲜的小鼠脑组织线粒体加入Seahorse XF24孔板，以分别向探针板A、B、C、D孔加入二磷酸腺苷(ADP)、寡霉素(Oligomycin)、羧基-氰-对三氟甲氧基(FCCP)、抗霉素/鱼藤酮(Antimycin A/Rotenone)，校正探针板后，将孔板置于Seahorse XF24生物能量代谢分析仪中进行检测。

2 结果

2.1 生酮饮食及高原低氧环境下小鼠海马组织的病理学改变尼氏染色结果显示，NC组小鼠海马组织神经元细胞(CA1、CA3区、齿状回部位)排列整齐，染色均一。与NC组相比，HC组海马CA1、CA3区细胞排列疏松，细胞数量减少，着色较浅，齿状回部位细胞核固缩深染。与HC组相比，HK组海马CA1、CA3区细胞排列逐渐整齐，细胞数量逐渐增多，齿状回部位核固缩深染的细胞数量逐渐减少(图1)。以上结果说明生酮饮食能有效改善高原低氧环境下小鼠海马神经元的损伤。

2.2 生酮饮食及高原低氧环境下小鼠海马组织线粒体分裂/融合相关蛋白的表达变化Western blot 结果显示，与NC组相比，HC组的MFN1表达降低(F=7.43,P<0.05)，FIS1表达增加(F=8.22,P<0.05)。与HC组相比，HK组的MFN1表达增加(F=8.22,P<0.05)，FIS1表达降低(F=8.73,P<0.05)(图2)。说明高原低氧环境降低了海马组织线粒体的融合能力而促进了线粒体的分裂。给予生酮饮食后，低氧环境下海马组织线粒体的融合能力相对提高，线粒体的分裂相对减少，线粒体的功能相对改善。

图1 生酮饮食调节高原低氧环境下各组小鼠海马组织形态结构的变化(尼氏染色)

2.3 生酮饮食调节高原低氧环境下小鼠脑组织线粒体的耗氧率(OCR)Seahorse结果显示，与NC组(271.95±90.87)相比，HC组(142.68±69.99)中由ADP刺激引起的线粒体耗氧率降低(F=15.54,P<0.01)；与HC组相比，HK组(207.51±89.55)中由ADP刺激引起的线粒体耗氧率增加(F=7.76,P<0.05)。由FCCP刺激引起的线粒体耗氧率，与NC组(229.76±51.82)相比，HC组(147.77±39.55)降低(F=13.64,P<0.05)；与HC组相比，HK组(200.28±60.22)增加，差异无统计学意义(图3)。说明生酮饮食可以增加低氧环境下小鼠脑组织线粒体的耗氧率，即提高线粒体的氧化呼吸能力，从而改善线粒体功能。

4 讨论

有关研究[3]表明，高原低氧环境可以造成不同程度的脑组织损伤而导致感知、判断、注意力和记忆力等认知功能受损。Nation et al[4]发现当飞行员急性暴露于模拟高空低氧环境时可造成学习和记忆能力的快速损伤。Zheng et al[5]发现将小鼠置于模拟海拔6 100米的低压氧舱内7 d后小鼠的记忆和认知能力下降。大脑对低氧环境极不耐受，其中参与感知、情绪、学习和记忆等认知过程的海马组织对低氧又非常敏感，高原低氧环境可以造成海马神经元的损伤，从而导致大脑认知功能障碍，可能与海马神经元氧化应激、病理性损伤、细胞凋亡等有关[6-7]。本研究通过模拟6 000米海拔高度下的高原低氧环境亦发现了小鼠海马神经元病理性损伤的发生，低氧对照组小鼠海马神经元出现细胞排列紊乱、细胞数量减少、核固缩深染等凋亡或坏死的病理学改变，但是小鼠在此低氧环境下是否发生由海马神经元损伤导致的认知功能障碍还需要更多实验证明。

近些年来，对生酮饮食的研究热点主要聚焦于其对肥胖、2型糖尿病等糖脂代谢性疾病方面潜在的获益和临床价值[8]。研究[9]表明，生酮饮食可以改善心脏功能、延长寿命、改善记忆功能。Lee et al[10]发现外源性β-羟丁酸可以对缺血缺氧性脑病乳鼠模型产生神经保护作用，也有研究[11]表明生酮饮食可以作为组蛋白去乙酰酶复合物抑制剂上调脑源性神经营养因子BDNF而改善低氧认知功能障碍。所以，生酮饮食用于癫痫、脑卒中等疾病时可以观察到其神经保护作用，但对高原低氧性脑损伤的作用研究较少。本实验在高原低氧前给予小鼠生酮饮食，减轻了小鼠海马神经元病理性损伤，提示生酮饮食可以改善高原低氧环境下小鼠海马组织病理性损伤和结构变化，从而发挥保护作用。

为了进一步探讨生酮饮食对低氧环境下小鼠海马神经元损伤的保护作用，本实验研究了生酮饮食对低氧环境下小鼠海马神经元的线粒体功能的改变。线粒体是机体能量代谢的细胞器，其数量及形态具有高度可塑性，各种外界刺激都会促使其移动、合成、分裂、融合，其中，线粒体分裂/融合动态平衡在细胞代谢过程中或遭受应激过程中对线粒体质量和功能的维护扮演着重要角色[12]。线粒体的分裂能够使线粒体片段化，破坏线粒体的完整性，由分裂蛋白Drp1和Fis1调节。线粒体融合能够通过融合蛋白MFN1、MFN2和OPA1调节促进不同程度受损的线粒体之间相互融合而得到修复，减少损伤的线粒体，改善线粒体功能。有研究[13]显示线粒体受损时，线粒体动力学功能障碍而导致线粒体分裂增加，可以导致促凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡，而Guo et al[14]在缺血性脑病模型中发现生酮饮食可以抑制线粒体分裂并保护线粒体完整性从而发挥神经保护作用。本实验在高原低氧环境下观察到小鼠海马神经元线粒体分裂/融合失衡，线粒体分裂增加，线粒体完整性被破坏，有可能因此诱发海马神经元的凋亡而导致海马组织结构改变。给予生酮饮食后低氧暴露，结果发现线粒体融合增加，受损的线粒体彼此融合而节约能量代谢底物，从而改善了线粒体功能，改善了海马神经元的损伤。因此，高原低氧环境下小鼠海马神经元线粒体分裂/融合失衡在海马组织损伤和结构改变中起重要作用，而生酮饮食可能通过改善线粒体分裂/融合失衡，从而发挥脑保护作用。

线粒体还是细胞氧化磷酸化和产生ATP为机体的生命活动提供能量的重要场所，低氧环境下，线粒体氧化磷酸化和电子链的传递受限，导致ATP产生减少，ROS产生增多，可能进一步诱导细胞凋亡[15]。线粒体的氧化呼吸能力可以由Seahorse检测线粒体耗氧率来评估，本实验中给予ADP刺激和给予FCCP刺激后，HC组较NC组耗氧率降低，HK组较HC组耗氧率增加，可以提示高原低氧环境下小鼠脑组织线粒体氧化呼吸能力的降低，而生酮饮食可以改善高原低氧下线粒体氧化呼吸能力。我们观察到，给予FCCP刺激后，HK组较HC组耗氧率增加的结果没有明显的统计学差异，可能是因为样本数量较少，以及在低氧环境和生酮饮食条件下，海马神经元细胞线粒体糖酵解能力的变化，还需要进一步的实验证明。

综上，本研究显示生酮饮食能改善高原低氧环境下小鼠海马神经元的损伤，并通过改善海马神经元线粒体分裂/融合失衡和线粒体氧化呼吸功能，进而改善海马组织结构和能量代谢，减轻脑组织损伤，发挥脑保护作用。