稀酸-碱湿法氧化预处理对玉米秸秆酶解性能影响

安胜欣， 李雨晴， 薛凤洋， 冯承涛， 李文志*

(1.安徽理工大学 化学工程学院，安徽 淮南 232001；2.中国科学技术大学 工程科学学院，安徽 合肥 230026)

化石能源潜在短缺及使用对环境造成的压力，迫使人们寻求环保型可替代资源[1]。木质纤维素生物质主要由碳水化合物(纤维素、半纤维素)和木质素等组成，因存储量大、可再生等特点引起了人们广泛关注[2-4]。与风能、太阳能等可再生能源相比，生物质资源具有无可比拟的优越性，如既能转化为燃料又可用于生产化学品，因此成为化石资源理想替代品。农作物秸秆是一类典型的木质纤维素，我国是农业大国，秸秆资源非常丰富。而我国秸秆的利用率较低，大部分直接焚烧容易污染环境。积极开发秸秆的利用途径，对降低环境污染和加强秸秆资源的有效利用具有重要的理论和现实意义。

酶水解纤维素类生物质建立糖分子平台，以此平台为基础进一步生产生物基燃料和化学品是生物质转化利用的主要途径之一[5-7]。但生物质结构复杂致密，尤其是木质素的存在，使得秸秆直接酶解效率低，需经过一定预处理才有效获取糖分子建立糖分子平台[8-9]。常用预处理方法有化学法、物理法、物理——化学法、生物法[10-12]。由于生物质组分化学性质和结构差异，常规的一步预处理很难实现在大量脱除木质素的同时而不引起糖的过度降解[13]。本文拟以玉米秸秆为原料，采用稀酸-碱湿法氧化两步预处理，先用稀酸预处理回收半纤维素，再用碱湿法氧化脱除木质素释放纤维素，以纤维素酶水解纤维素获取C6分子。通过两步预处理，可实现C5和C6糖分子分步回收，两步预处理后的废液可相互中和，降低环境污染。本文考察碱湿氧化法中不同预处理条件对酶解葡萄糖收率的影响，通过SEM、BET对预处理前后的样品进行表征，考察预处理对秸秆结构的影响，为玉米秸秆的高效转化利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

玉米秸秆来自安徽省蒙城县；氨水、过氧化氢、盐酸、硫酸、葡萄糖、木糖等试剂由国药集团化学试剂公司提供，所用试剂均为分析纯；纤维素酶由诺维信中国投资有限公司捐赠。

1.2 主要仪器与设备

机械搅拌釜(安徽科幂机械科技有限公司)；YC-068高速粉碎机(广州市赛豪机械有限公司)；Waters液相色谱仪(沃特世科技(上海)有限公司)，Tristar II 2030M 全自动比表面积及孔隙度分析仪(美国麦克仪器公司)，Genimi SEM 500场发射扫描电子显微镜(卡尔蔡司上海管理有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 原材料预处理 将收割的玉米秸秆自然风干后，用粉碎机粉碎成小片段。将小片段玉米秸秆用自来水清洗去除灰尘及非秸秆类杂质，85 ℃烘箱烘干。烘干后样品用高速粉碎机粉碎后过40目筛，置于干燥环境中贮存备用。

1.3.2 稀酸-碱湿法氧化两步预处理 以稀盐酸预处理作为第一步用于脱除半纤维素回收木糖[14]。第二步采用碱湿法氧化法预处理，将第一步预处理后的残渣用去离子水冲洗至中性，放入机械搅拌釜中，加入一定量氨水过氧化氢溶液，在一定温度下预处理一定时间。当温度达到设定温度时开始记时，反应结束后，反应釜用自来水冷却至室温，抽滤回收固体残渣，并用去离子水冲洗至中性用作下一步酶解反应的原料。考察预处理温度、氨水浓度、预处理时间、过氧化氢用量对秸秆组分含量及残渣纤维素酶解葡萄糖收率的影响。

秸秆纤维素酶解方法

1.3.3 酶水解 取5 mL EP管，加入干重为0.2 g的两步预处理后的残渣、一定量纤维素酶，补充含有抑菌剂的醋酸钠-醋酸缓冲液使整个反应体系总体积为4 mL。将离心管放入培养箱，50 ℃，120 rmp/min震荡培养72 h。酶解反应结束后，将固体和液体高速离心分离，滤液用0.22 μm微膜过滤后HPLC测定酶解葡萄收率。

1.3.4 分析方法样品组分的测定 采用美国可再生能源实验室提供的方法进行[15]。纤维素酶活力的测定采用滤纸酶活方法。

纤维素含量=C2/C1×100%

其中,C1为原料中纤维素的质量；C2为预处理残渣纤维素的质量。

木质素含量=M1/M2×100%

其中M1为原料中木质素的含量；M2为预处理残渣木质素的质量。

酶解葡萄糖收率=E1/E2×100%

其中,E1为原料中葡萄糖的含量；E2为酶解得到的葡萄糖的含量。

1.3.5 表征方法 对预处理前后的样品通过扫描电子显微镜(SEM)观察预处理对样品表观形貌的影响，采用全自动比表面积及孔径分析仪分析样品比表面积及孔隙率的变化，其中N2脱附条件为90 ℃脱气30 min；孔体积测定采用单点测试法，即在P/P0=0.973时总孔体积。

2 结果与分析

2.1 秸秆组分

采用美国可再生能源实验室的方法进行测定，玉米秸秆各组分的含量分别为：纤维素33.9%、半纤维素22.5%、阿拉伯聚糖2.9%、半乳糖1.3%、木质素20.5%、抽提物9.8%、灰分4.1%及其他5.0%。结构组成表明，玉米秸秆含有的主要组分为纤维素、半纤维素和木质素。纤维素为葡萄糖聚合物，半纤维素主要由木糖构成，在研究中以葡聚糖和木聚糖的收率来代表组分中纤维素和半纤维素含量的变化以及酶解效果。

2.2 稀酸预处理对组分及酶解葡萄糖收率的影响

稀酸预处理是水解半纤维素常用方法，可在较温和条件下实现半纤维素有效水解。根据本课题组研究，相比于硫酸，盐酸更适合用于木质素脱除[16]。研究采用1 wt%HCl、120 ℃预处理玉米秸秆40 min，考察预处理前后玉米三大组分的变化，以及对酶解收率的影响(图1)。

图1 稀酸预处理对组分a及酶解葡萄糖收率的影响

从图1可知，在设定的预处理条件下残渣中半纤维素保留率变化最大，83.1%木聚糖可回收；纤维素和半纤维素保留率变化不大，符合预处理的要求。对酸预处理前后的样品酶解，酶用量为3 FPU/g，结果见图1。由图1可以看出，与原料相比，预处理后的样品葡萄糖收率从23.1%增加到37.2%。这归因于，秸秆基质结构致密直接酶解效率较低，酸预处理后随着半纤维素脱除，秸秆的基质结构遭到破坏，酶解效率提高，糖收率增加。

2.3 H2O2用量对酶解葡萄糖收率的影响

将稀酸预处理后残渣，先用去离子水冲洗至中性，抽滤后用于下一步氨水过氧化氢预处理。在110 ℃、40 mL 25～28%氨水过氧化氢溶液、预处理时间为30 min条件下，考察不同过氧化氢用量对随后酶解葡萄糖收率的影响(H2O2用量是以所用H2O2占整个反应体系的体积来计算)，结果见图2。由图2可以看出，随着氨水中过氧化氢用量增加，残渣中纤维素的含量大于86%，说明在设定实验条件下，氨水过氧化氢湿法预处理对纤维素的影响较小，这符合预处理的要求，预处理后可以尽可能多的保留纤维素为后续酶解提供充足原料。随着H2O2用量增加，木质素脱除率从86.4%增加到89.5%，酶解葡萄糖收率从44.3%增大到80.6%。这说明过氧化氢用量的增加虽对木质素的脱除影响不大，但对后续酶解性能影响较大。这可能归因于木质素脱除及半纤维素的脱除对残渣基质结构的影响也会影响纤维素酶的酶解效率，而这种影响有利于酶解效率的提高。由图可知随着过氧化氢用量提高，残渣中葡聚糖保留率呈下降趋势，综合考虑将6.0%H2O2作为后续反应过氧化氢的用量。

图2 H2O2用量对酶解糖收率的影响

2.4 氨水浓度对酶解葡萄糖收率的影响

在110 ℃、6.0%H2O2、30 min、氨水过氧化氢体系体积为40 mL条件下，考察不同氨水质量分数(1.0%、7.3%、10.9%、18.3%)对后续酶解葡萄糖收率的影响(氨水用量是以所用氨水量占整个反应体系的体积来计算)，结果见图3。随着氨水用量增加，残渣中葡聚糖含量有小幅度降低，但依然保持在83%以上，说明在本研究采用条件下，纤维素结构稳定并未出现大量的降解。由图3看出，随着氨水用量增加，木质素脱除率从57.8%提高到86.4%有明显上升趋势，同时酶解葡萄糖收率有显著增加，由44.5%上升到58.5%。这可以从氨水湿法氧化作用机理来解释：在碱性环境中(pH>11.5)，过氧化氢会分解成高活性离子(HO·、O2-·、HOO-)，这些高活性离子通过进攻木质素侧链基团将大片段木质素氧化降解成小片段，加速木质素脱除。本文所选氨水用量所对应pH分别为10.8、11.8、12.8和12.8，随着反应体系中pH增大，过氧化氢分解产生的活性离子量增大，碱氧脱木质素作用增强，木质素脱除率增加。随着木质素脱除量增加，再加上第一步半纤维素的脱除，秸秆的基质组分被破坏，阻挡纤维素酶屏障作用消除或者减弱，纤维素酶的作用位点增加，纤维素的水解效率增强。由图3还可看出，随着氨水用量增加，纤维素的剥皮反应作用增强，残渣中纤维素保留率呈下降趋势，综合考虑将18.3%作为后续反应氨水用量。

图3 氨水浓度对酶解糖收率的影响

2.5 预处理温度对酶解葡萄糖收率的影响

在18.3% 氨水用量、6.0%的H2O2、30 min，氨水过氧化氢体系体积为40 mL，考察不同预处理温度对随后酶解葡萄糖收率的影响，结果见图4。提高预处理温度，木质素脱除量从59.4%增加到88.5%，酶解葡萄糖收率从49.4%增加大64.7%。这主要是因为随着预处理温度升高，过氧化氢分解的高活性离子反应性增强，碱氧脱木质素反应速率加快，致使更多木质素脱离基质，残渣中木质素含量逐渐变小。随着木质素和半纤维素脱离秸秆机体，秸秆的基质结构被破坏，阻止纤维素酶物理屏障消失或减弱，更多纤维素暴露出来，纤维素酶的可及性增加，酶解葡萄糖收率增加。由图4可知，随着温度升高，纤维素含量呈现下降的趋势，这是由两个方面引起的，一是随着预处理温度升高，碱性条件下纤维素剥皮反应速率增加，部分纤维素降解；二是由于温度升高，碱过氧化氢产生的高活性离子量增加，这些高活性离子攻击纤维素官能团引起纤维素氧化降解。综合考虑选用130 ℃作为后续预处理温度。

图4 预处理温度对酶解糖收率的影响

2.6 预处理时间对酶解葡萄糖收率的影响

在130 ℃、 6%过氧化氢用量、18.3% 氨水用量，氨水过氧化氢体系体积为40 mL，考察不同预处理时间对随后酶解葡萄糖收率的影响，结果见图5。由图5看出，延长预处理时间，木质素脱除量明显增大，从75.4%增加到88.5%；当从20 min延长到30 min，纤维素残渣酶解葡萄糖收率显著增加，从55.8%增加到65.7%，再延长时间，变化不明显。这归因于随预处理时间延长，碱氧脱木质素反应时间延长，更多木质素脱离基质，残渣中木质素含量降低，生物质基质结构被破坏，残渣中更多纤维素暴露出来，纤维素酶作用位点增加，酶解效率增加，葡萄糖收率增加。再延长时间，木质素脱除率虽在增加，但木质素脱除到一定程度后木质素脱除对酶解性能影响减弱[17]，所以预处理时间从30 min延长至60 min，酶解葡萄糖收率变化趋于缓和。由图5可知，随着预处理时间的延长，残渣中纤维素的含量逐渐下降，这是因为延长预处理时间，在碱氧环境中，纤维素氧化降解和剥皮反应的时间延长，致使纤维素发生部分降解。综合考虑，30 min作为合适预处理时间。

图5 时间对酶解葡萄糖收率的影响

2.7 表征分析

采用SEM考察预处理对玉米秸秆表观形貌的影响，结果见图6。由图6可以看出，原料表面光滑、致密，纤维素酶不容易进入基质内部，导致直接酶解葡萄糖收率低。预处理后样品表面粗糙、孔隙增多，并且有碎片从表面脱落，这是由于秸秆组分半纤维素、木质素的脱除引起的，表观形貌的改变可以增大纤维素与纤维素酶接触的机会，使得酶解效率增加。

图6 预处理前后样品的SEM图像(a 未处理；b 预处理后)

通过全自动比表面积及孔径分析仪分析预处理前后样品的比表面积及孔隙变化，考察预处理对样品结构的影响，结果见表1。由表1可知，与原料相比，预处理后的样品比表面积增大到1.567 5 m2/g，孔体积增加到0.003 1 cm3/g，表明预处理后由于半纤维素和木质素脱除，秸秆基质的致密的结构被破坏，预处理样品的比表面积及孔体积增加。残渣比表面积和孔体积的增加会为后续水解的纤维素酶创造更多的活性位点，纤维素酶的可及性增大，酶解效率增强。

表1 预处理前后样品的比表面积及孔体积

注：a.两步预处理条件：HCl预处理120 ℃、40 min、1%HCl、料液比1∶10 g/mL；氨水过氧化氢预处理条件为：6%过氧化氢用量、18.3% 氨水用量、130 ℃、40 min；b.用N2吸附法测定比表面积。

3 结论与讨论

采用稀酸-氨水过氧化氢两步预处理玉米秸秆，先通过稀盐酸预处理回收半纤维素，再通过碱氧预处理脱除木质素，使得后续残渣酶解效率增强。考察了预处理时间、温度、氨水用量、过氧化氢用量对酶解性能的影响。研究发现，随着预处理条件增强，木质素脱除率增加，纤维素酶解葡萄糖收率增大，但是过于苛刻的条件会引起纤维素的降解。通过SEM、BET表征发现，酶解性能的提高归因于预处理引起玉米秸秆基质结构变化，表面变的粗糙、孔隙增多、且有小片段脱落，秸秆的比表面积和孔体积增大，纤维素酶的可及性及作用位点增多。在本研究设定条件下，1 wt% HCl预处理、120 ℃预处理40 min、料液比1∶10 g/mL可回收83.1%木糖；氨水过氧化氢预处理条件为：130 ℃、6%过氧化氢用量、30 min、18.3wt%氨水、3 FPU/g酶用量下得到65.7%葡萄糖，实现了低酶用量下较高的糖收率。