Hsf1在DEN 诱导小鼠急性肝损伤中的表达及活性变化

张舒曼 董 烁 李淑莲*

1.河南大学淮河医院 外科，河南 开封 475001; 2. 河南大学 细胞与分子免疫学实验室，河南 开封 475004

热休克转录因子1 (heat shock transcription factor1，Hsf1)是调节细胞保护性应激蛋白-热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)表达的主要转录因子，能够被热应激、氧化应激等多种理化因素激活[1-3]。近年研究发现，多种炎症疾病的发生、发展过程中伴有Hsf1表达变化，如心肌炎、肺部炎症、关节炎等多种炎症疾病过程中均有Hsf1的显著改变。Hsf1能够通过诱导Hsp表达，发挥间接抗炎反应，也可通过多条途径发挥直接抗炎效应。

本实验应用C57小鼠腹腔注射二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)24 h或48 h造成小鼠肝组织急性损伤，检测小鼠肝组织Hsf1及其调控蛋白，分析Hsf1在急性肝损伤性炎症中的表达及活性变化，丰富Hsf1与炎症疾病相关研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

C57BL/6J小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司);二乙基亚硝胺(购自Sigma公司);谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(购自上海申能-德赛诊断技术有限 公司);Hsf1 抗体、Hsp25 抗体(购 自Santa Cruz Biotechnology 公 司);Hsp70 抗 体、Hsp90 抗体(购自中杉金桥公司);ECL 显影试剂盒(购自Amershem Pharmacia 公司);PVDF 膜(购自Milipore 公司);垂直电泳仪及电转装置(Thermo EC公司产品);凝胶图像分析仪Alphalmager2200(Alpha Inntech公司产品)。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6J小鼠急性肝损伤模型的建立

选取8周龄C57BL/6J雄性小鼠30只，体质量为(30±5)g。将30 只小鼠随机分为对照组(n=10)、 DEN 损伤24 h组(n=10)及DEN 损伤48 h组(n=10)。DEN 损伤组C57BL/6J小鼠给予腹腔注射二乙基亚硝胺溶液，20 mg/kg;对照组腹腔注射同体积PBS溶液。三组小鼠均常规饲养，饮用商用纯净水。小鼠腹腔注射二乙基亚硝胺溶液24 h(DEN 损伤24 h组)或 48 h(DEN 损伤48 h组)，眼球取血后处死动物。

1.2.2 肝组织病理检查

C57BL/6J小鼠腹腔注射二乙基亚硝胺24 h或48 h后，迅速拉颈处死小鼠，并快速摘取小鼠肝脏，切取部分肝组织，置于体积分数为4%的多聚甲醛中固定。常规石蜡包埋、切片、HE 染色，光学显微镜下观察肝组织病理变化。

1.2.3 ALT、AST 及ALP的活性测定

C57BL/6J小鼠腹腔注射二乙基亚硝胺溶液24 h或48 h后，眼球取血，收集血清。按照试剂盒说明检测血清ALT、AST 和ALP活性。

1.2.4 提取小鼠肝组织蛋白

小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后脱颈处死，迅速摘取肝脏，切取适量肝脏组织，置于少量组织裂解液中，用无菌眼科剪剪碎肝组织，加组织裂解液(20 mM HEPES pH 7.5， 0.35 M NaCl， 20%甘油， 1% NP-40， 1mM MgCl2 86H2O， 0.5mM EDTA， 0.1 mMEGTA， PMSF)，冰上超声裂解5 s×3次后冰上放置30 min，4 ℃， 12 000r/min，离心5min，收集上清，用BCA 法检测上清液蛋白浓度。

1.2.5 小鼠肝组织Hsf1 及调控蛋白Hsp70、Hsp90、Hsp25蛋白检测

常规提取小鼠肝组织蛋白60 μg，SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜。用含质量分数为5%的脱脂奶粉于TBST 室温封闭PVDF膜1 h，洗涤4次，分别加入抗小鼠Hsf1、Hsp70、Hsp90、Hsp25 抗体，室温孵育2 h，洗涤4次。将膜封闭于HRP 标记的二抗稀释液中，室温孵育1 h， TBST 洗膜后，于ECL反应液中再反应1 min，暗室显影。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差(±s)表示，单因素方差分析，P＜0.05视为有统计学差异。

2 结果

2.1 小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶活性变化

小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后，眼球取血，检测血清ALT、AST、ALP的活性。与正常对照组小鼠比较显示，DEN 24 h组小鼠血清ALT、AST 、ALP活性分别较对照组升高574.97%、86.67%、174.49%(P＜0.05)。DEN 48 h组小鼠血清ALT、AST 、ALP活性分别较对照组升高665.63%、95.33%、194.90%(P＜0.05)。结果见图1。

图1 小鼠血清ALT、AST、ALP活性比较

2.2 C57BL/6J小鼠肝组织病理变化

正常对照组小鼠肝脏组织内肝索放射状排列，肝小叶结构清晰，肝脏细胞结构完整， 细胞核、细胞质均匀分布，肝组织中央静脉和汇管区结构完整。与对照组小鼠比较， DEN 24 h组小鼠的肝脏体积明显增大，并有充血现象;显微镜观察可见肝组织正常结构破坏，肝细胞排列紊乱，细胞水肿，肝组织点状及灶性坏死，伴有炎性细胞浸润等。DEN 48 h组小鼠肝脏组织及细胞损伤性变化更显著。以上结果提示，小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h，导致肝组织急性严重损伤。结果见图2。

图2 DEN 损伤小鼠肝组织病理变化 (×200)

2.3 小鼠肝组织Hsf1蛋白表达

小鼠肝脏组织常规蛋白凝胶电泳、转膜，免疫印迹检测Hsf1蛋白表达。结果显示，小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后，肝组织Hsf1蛋白条带较对照组明显增粗。结果见图3。

图3 DEN 损伤小鼠肝组织Hsf1蛋白表达

2.4 小鼠肝组织Hsp70、Hsp90、Hsp25蛋白表达

取各组小鼠肝组织蛋白裂解液，常规SDSPAGE电泳，转移PVDF膜，免疫印迹检测Hsp70、Hsp90、Hsp25蛋白表达。结果发现，小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后，小鼠肝组织Hsp70、Hsp90及Hsp25蛋白条带均较对照组明显增粗。结果见图4。

图4 DEN 损伤小鼠肝组织Hsp70、Hsp90、Hsp25蛋白表达

3 讨论

热休克转录因子(Hsf)是一组在结构和功能进化中比较保守的同源蛋白质，普遍存在于生物细胞中。Hsf家族有Hsf1、Hsf2、Hsf3 和 Hsf4 四个成员，哺乳动物基因有Hsf1、Hsf2 及 Hsf4，鸟类基因中只含Hsf3。不同种属的Hsf虽然结构相似，但功能有着不同程度的差异，在Hsf家族中，Hsf1最具特征性，Hsf1在多个器官组织中均有表达，是调控细胞热休克蛋白(Hsp)表达的主要转录因子[1-3]。近年研究发现，Hsf1不仅是调控 Hsp 表达的主要转录因子，也与肿瘤、炎症等多种疾病的发生、发展密切相关。Hsf1不仅能够通过诱导不同的Hsp表达而发挥间接的抗炎反应[4-5]， 还具有重要的直接炎症抑制作用。目前研究提示，Hsf1发挥直接抗炎效应可能通过三个途径:①Hsf1 能够抑制炎症因子转录。Hsf1 能够与肿瘤坏死因子TNF-α基因上多个热休克元件 (heat shock element， HSE) 结合，从而使TNF-α的转录受到抑制，进而减轻细胞的炎症反应，而Hsf1 基因缺失小鼠对脂多糖 (lipopolysaccharid， LPS) 所致全身炎症反应综合征的敏感性增加，血浆TNF-α等炎症介质的水平增高，Hsf可保护小鼠免受脂多糖诱导的急性肺损伤[6-10];Hsf1也可抑制白细胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)、白 细 胞 介 素12(interleukin 12， IL-12)等炎症介质的转录;Hsf1 还能对心肺炎症、哮喘、关节炎、内毒素血症等炎性疾病的多种相关炎症介质进行调控[11-13]。② Hsf1促进抗炎因子生成。Hsf1能够促进白细胞介素4(interleukin 4， IL-4)、白细胞介素 10(interleukin 10， IL-10)、转化生长因子 β(transforming growth factor β， TGF-β) 等多种抗炎因子生成[14-15]。 ③Hsf1 调控炎症信号通路中相关转录因子。Hsf1通过竞争性抑制作用，抑制 NFκB的激活，阻止NF-κB 诱导的信号转导，Hsf1也可直接抑制 AP-1的活化，减轻炎症反应程度[16-17]。

二乙基亚硝胺(DEN) 具有选择性肝脏毒性，是常用的肝癌诱导剂。DEN 对肝脏的毒性作用历经一系列过程，DEN 首先使大鼠肝脏发生肝组织变性和坏死等中毒性改变，继而出现肝硬化，最后形成弥漫性肝癌，即DEN 对肝脏的毒性作用，经历肝炎、肝硬化、进而形成肝癌。课题组应用间断低剂量DEN 诱导小鼠肝癌模型[18]中发现应用DEN 是制作急性肝损伤模型较好的方法。本实验应用C57BL/6J小鼠，腹腔注射DEN 24 h或48 h ，通过检测小鼠血清酶活性及肝组织病理变化，确定小鼠急性中毒性肝损伤(炎症)模型的建立。结果显示，小鼠腹腔注射DEN 24 h或48 h后，小鼠血清酶活性明显增高，肝组织正常结构破坏，损伤性炎症变化明显。进一步应用免疫印迹方法检测小鼠肝组织Hsf1及其调控蛋白表达，发现小鼠腹腔注射DEN 24 h后，肝组织Hsf1及其下游蛋白Hsp70、Hsp25较对照组肝组织明显增多。腹腔注射DEN 48 h后，上述变化更显著，提示DEN 诱导的急性肝组织损伤中，Hsf1 表达增多，转录活性增高。Hsp70、Hsp90、Hsp25均是Hsf1调控Hsp家族的重要成员，Hsp是机体重要的应激保护蛋白，Hsp可通过调节细胞死亡的关键信号通路，减少活性氧物质(reactiveoxygen species，ROS) 形成等作用发挥细胞保护作用[19]。推测本实验中Hsp70、Hsp90、Hsp25表达增多，可能通过其肝细胞保护作用，减轻DEN 造成的肝脏损伤，但DEN 诱导的急性肝损伤组织Hsp70、Hsp90及Hsp25表达增多的确切作用，以及Hsf1的表达增多是否具有直接抗炎作用尚需进一步研究。