生防地衣芽孢杆菌最佳发酵条件探究

徐亚英 黄晓梅 谢丽

摘 要 通过单因素试验对地衣芽孢杆菌发酵培养基配方及条件进行优化。结果表明，该菌菌株培养基最佳配比为蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化钠1%，最佳培养条件是初始pH值8.5、温度37 ℃、时间36 h、三角瓶装液量125 mL、接种量4%、转速200 r·min-1。该研究为地衣芽孢杆菌的大规模工业化发酵培养提供了有益借鉴。

关键词 地衣芽孢桿菌;发酵条件优化;单因子试验

微生物制剂是现在各国竞相研究开发的新产品。我国原农业部于2003年就公布了可用于生产微生态制剂的芽孢杆菌属菌种有地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等。地衣芽孢杆菌是一种益生菌，是革兰氏阳性好氧菌，化能异养，在一定条件下能产生抗逆性内生孢子[1-3]。近年来，国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多，是芽孢杆菌中具有较大应用前景的菌种之一，在医药、农药、饲料加工等行业中都取得了较好的研究成果[4-6]。但该杆菌在动物微生态制剂及植物病虫害防治方面的应用仍处于发展阶段，发展潜力较大。尤其是在植物微生态制剂上的应用，具有重要的发展意义。

地衣芽孢杆菌在自然界中分布十分广泛，是植物及土壤微生态的优势种群;能分泌抑制或者杀死病原菌的次级代谢产物，对许多植物的病原菌有较好的抑制作用，如对核盘菌、镰刀菌、水稻纹枯病病菌和稻瘟病病菌等均具有较好的抑菌作用，具有较好的生防潜力，已经成功用在植物病害的生物防治方面[7-10]。目前，登记的相关农药制剂为地衣芽孢杆菌水剂，由广西金燕子农药有限公司研制，含80亿个/mL活芽孢，主要防治黄瓜保护地的霜霉病。但在将地衣芽孢杆菌制成微生态制剂时，保证含有大量的细胞、芽孢且成本较低是一个重要前提[11]。基于此，采用单因素试验研究不同发酵培养基及不同培养条件对地衣芽孢杆菌培养的影响，以期为降低地衣芽孢杆菌高密度培养的成本提供一定的理论依据，使其能够满足微生物菌剂的生产要求。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

地衣芽孢杆菌由黑龙江农业职业技术学院分析检测中心微生物试验室筛选保存;可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、麦芽糖、酵母提取物、硫酸镁、牛肉膏、尿素、硫酸铵、氯化铵、氯化钠、氯化钙和磷酸二氢钾等均为分析纯试剂。

种子培养基与基础发酵培养基均是LB培养基，即蛋白胨10 g·L-1、酵母浸出物5 g·L-1、氯化钠10 g·L-1，自然pH。

主要设备有紫外-可见分光光度计、高压蒸气灭菌锅、生化培养箱、恒温培养振荡器、pH计、精密电子天平、无菌操作台等。

1.2 试验设计

1.2.1 培养方法

1.2.1.1菌种活化

将保存菌种转接至LB固体培养基上，37 ℃培养至24 h待用。

1.2.1.2种子液制备

挑取已活化的单菌落接种到含50 mL液体培养基的三角瓶中，160 r·min-1、37 ℃摇床振荡培养16～18 h后待用。

1.2.1.3摇瓶培养

分别取一定量的种子液，按2%的接种量接至含培养基的三角瓶中;在200 r·min-1、37 ℃摇床中培养36 h，进行单因素试验的发酵培养研究。

1.2.2 培养基配方优化试验设计

1.2.2.1碳源

分别用5 g·L-1的酵母粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、麸皮和可溶性淀粉等量取代基础培养液的碳源。使用摇瓶发酵培养，36 h后通过测定发酵液的活菌数来确定最佳碳源。

1.2.2.2氮源

依次用10 g·L-1的豆粉、蛋白胨、硫酸铵、牛肉膏、硝酸铵、尿素和氯化铵替代基础发酵液的氮源。使用摇瓶发酵培养，36 h后通过测定发酵液的活菌数来确定最佳氮源。

1.2.2.3无机盐

依次用10 g·L-1的NaCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4和KCl等量替代基础发酵液的无机盐。采用摇瓶发酵培养，36 h后通过测定发酵液的活菌数来确定最佳无机盐种类。每个处理3次重复，其他发酵条件同1.2.1.3。

1.2.3 培养条件优化设计

使用筛选出的最佳培养基配方，先固定摇瓶培养的其他发酵条件，对初始pH、装液量、温度、接菌量、发酵时间等发酵条件进行优化。初始pH值依次调为5.5、6.5、7.5、8.5和9.5;接种量分别调为装液量的1%、2%、4%、5%、6%和8%;在250 mL三角瓶中分别装入25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、125 mL和150 mL发酵培养液;发酵时间分别设为12 h、24 h、48 h和60 h;温度分别设为30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃和45 ℃;转速分别设为100 r·min-1、150 r·min-1、200 r·min-1、220 r·min-1和250 r·min-1。每处理3次重复，其他发酵条件同1.2.1.3。

1.3 测定方法

以空白培养基为对照，菌体发酵液的测定采用比浊法，即发酵液10～15 mL在2 000 r·min-1下离心2 min，测定菌液的OD600值（溶液在600 nm波长处的吸光值），pH计测定菌液pH。

2 结果与分析

2.1 培养基优化

2.1.1 碳源

分别对不同碳源进行筛选，其他组分均相同进行发酵。通过试验可知，地衣芽孢杆菌生长的最佳碳源是酵母提取物，其次是麸皮。

2.1.2 氮源

试验对培养基的氮源进行了优化。结果发现，胰蛋白胨作为氮源，能大大促进地衣芽孢杆菌的生长，效果明显好于其他氮源，牛肉膏对地衣芽孢杆菌的生长影响不大，因此该杆菌生长的最适氮源是胰蛋白胨，这可能与胰蛋白胨含有较多的维生素、氨基酸和未知生长因子等有关。

2.1.3 无机盐

在上述最适碳源和氮源的基础上，分别对不同的无机盐进行筛选。结果表明，当使用原基础培养基中的无机盐进行培养时，地衣芽孢杆菌的OD600值最大，其次是CaCl2·2H2O。所以，地衣芽孢杆菌发酵培养基的最适无机盐仍为氯化钠。

2.2 发酵条件优化

2.2.1 初始pH

试验在配制了最佳培養基后，分别对不同pH进行测定。由试验可知，在初始pH值为5.5～8.5时，地衣芽孢杆菌发酵液OD600值随pH值的增加而增加，但初始pH值为8.5时的发酵液的OD600值最大，当培养液初始pH值大于8.5时，发酵液OD600值开始明显下降，且与初始pH 8.5的OD600值呈现显著性差异。因此，地衣芽孢杆菌最适初始pH值为8.5左右。

2.2.2 接种量

分别对不同接种量进行筛选，发现地衣芽孢杆菌生长的最适接种量为4%。在接种量为1%～4%时，随着接种量的增加，其发酵菌液OD600值略有升高，接种量>4%后，发酵液OD600值开始略有下降。

2.2.3 装液量

在摇瓶发酵的培养条件下培养至36 h，用比浊法测定发酵液OD600值。由试验可知，125 mL装液量的培养基内OD600值最大，随着装液量增大，活菌数具有下降趋势。

2.2.4 培养时间

最佳培养基的装液量为125 mL/250 mL、初始pH值调至8.5、接种量为4%时，测定不同摇菌时间对发酵液活菌数的影响。由试验可知，随着摇菌时间的增加，其OD600值也在增加，至36 h，OD600值为最大;随着培养时间的延长，36 h后含菌数逐渐减少，OD600值逐渐变小，地衣芽孢杆菌至生长衰亡期。因此，36 h为较合适的摇菌时间。

2.2.5 温度

在发酵培养的条件下培养至36 h，测定OD值。通过试验可知，该杆菌在37～45 ℃都能良好生长，故地衣芽孢杆菌生长的最适温度为37 ℃。

2.2.6 转速

分别测定不同转速对发酵液活菌数的影响。由试验可知，随着转速的提高，OD600值升高;转速超过200 r·min-1后，其OD600值反而下降。因此地衣芽孢杆菌的最适培养转速为200 r·min-1。

3 结论

试验表明，培养基成分配比与发酵条件均对地衣芽孢菌株的生长有较大影响。通过单因素试验确定地衣芽孢杆菌的优化培养基为5 g·L-1酵母提取物、胰蛋白胨10 g·L-1、氯化钠10 g·L-1，最适发酵条件为初始pH 8.5、发酵温度为37 ℃、发酵时间36 h、摇床转速200 r·min-1、接种量为4%。该研究为地衣芽孢杆菌的大规模工业化发酵培养提供了有益借鉴。

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（责任编辑：刘昀）