杂化纳米结晶及其体内命运研究进展

卢懿，黄味子，戚建平，吴伟

（复旦大学智能化递药教育部重点实验室，上海 201203）

纳米结晶是粒径在几十到几百纳米范围的药物晶体[1-2]，由于其显著地增加了药物颗粒的比表面积，可以极大地提高难溶性药物的溶出度[3]，进而改善其口服生物利用度，降低个体差异[2,4-5]。因此，纳米结晶技术最早被用于解决难溶性药物的口服给药难题，并取得了巨大成功[6]，迄今已经有10余种药物的纳米结晶口服制剂上市[7]。纳米结晶也可以混悬于溶液中用于注射给药，具有类似于纳米载体的递药性能。此外，由于不使用载体材料，纳米结晶理论载药量高达100%，也可避免由载体材料带来的安全性问题[8]。近年来美国FDA批准的用于静注治疗恶性高热的Ryanodex®（丹曲林钠）即是纳米结晶制剂，一瓶的剂量即可满足1名成年患者的治疗需求，从配制到注射也仅需1 min即可完成，而传统的丹曲林钠制剂在使用时需要将12瓶的剂量混合，配制时间更是长达20 min，不利于恶性高热这种急症的治疗。这些上市药物制剂的成功推动了纳米结晶技术的迅速发展，除了口服与注射途径外，纳米结晶在经皮给药、眼部给药和肺部给药方面也表现出巨大的应用前景[9-12]。

人们对于纳米结晶的体内过程仍然所知有限，甚至可能存在错误的认识。其中一个重要的原因在于，纳米结晶不含载体材料，不能像其他载体粒子那样对材料进行化学标记，进而通过荧光或放射性同位素追踪其体内转运过程。目前，对纳米结晶体内过程的研究主要基于药物的动力学和体内分布的数据，然而这些数据并不能解释纳米结晶的体内行为。这是因为，这些数据的获得需要从血液或组织中提取药物分析含量，提取的过程无法区分完整的纳米结晶和溶解的游离药物，由此推测得到的纳米结晶体内过程可能形成错误的结论。

近年来，普渡大学的Li等[13]成功研发杂化纳米结晶技术，通过将荧光探针或显影分子以物理包合的形式杂化入药物的晶格，使其发出荧光。这种技术可以在不改变药物的晶体性质和理化性质的基础上实现纳米结晶的体内示踪，为纳米结晶体内命运的研究提供了强有力的工具。本文在简要介绍当前纳米结晶体内命运的研究方法基础上，详细介绍杂化纳米结晶技术的基本概念和发展过程，并综述了基于杂化聚集导致淬灭（aggregation-caused quenching，ACQ）荧光探针的纳米结晶体内命运最新研究进展。

1 纳米结晶体内命运研究方法

1.1 透射电子显微镜

在组织器官中观察纳米结晶的结构是研究其体内命运最直接的方法，常用的观察工具是透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）。Rabinow等[14]静脉注射伊曲康唑纳米悬液后，通过TEM在大鼠脾脏切片中观察到了巨噬细胞内的药物结晶，据此推测纳米结晶注射后可能迅速被巨噬细胞吞噬，进而改变其药动学行为和体内分布特征。Fu等[15]对大鼠灌胃给予尼莫地平纳米结晶制剂后，在大鼠肠系膜淋巴液中观察到了结晶颗粒，进而推测纳米结晶口服后可以被整体摄取。TEM超高的分辨率是从生物组织背景中识别细小的药物纳米结晶的基础，但为了分辨纳米颗粒，观察视野往往被限制于非常狭小的区域之中，无法提供机体水平的转运和分布情况，及其动态过程[16]。更为重要的是，TEM的制样过程可能严重影响结果的准确性；现有研究中均使用乙醇进行组织脱水，势必使得未溶解的药物纳米结晶溶解，而后续步骤除去乙醇又会导致药物结晶析出；此外，染色剂引入的结晶性物质也可能干扰对结果的判断。

1.2 荧光药物

采用自身具有荧光的药物制备纳米结晶，可以通过荧光信号监测其体内转运过程。比如，通过激光扫描共聚焦显微镜研究姜黄素纳米结晶的透皮转运[17]；借助荧光分子香豆素6研究纳米结晶在马丁达比犬肾上皮细胞和斑马鱼幼体中的转运机制[18]；以及用可水解的二乙酸荧光素开展纳米结晶眼部转运研究[19]。虽然这些研究对揭示纳米结晶的体内命运具有重要参考价值，但该方式严重依赖药物的自发荧光，并不具备普适性。由于药物自身的理化性质（如溶解度、解离常数、油水分配系数）对于其纳米结晶的体内命运有极大影响，从少量模型药物中获得的研究结果并不能外推到所有药物的纳米结晶。更为重要的是，这些药物溶解后也能发出荧光，研究者所观察到的荧光信号实际是源于完整的纳米结晶和溶解的药物分子。随着时间的延长，更多药物溶解，荧光信号更多地呈现出药物分子的体内行为，与纳米结晶的差异越来越大。

2 杂化纳米结晶

2.1 基本概念

杂化结晶属于固体化学中客体包合的范畴[20-21]，是自然界中较为常见的现象，比如，彩钻、高碳钢和半导体等。一般地，杂化微量的客分子即可显著改变主分子的外观、机械强度和导电性等性能，但并不会改变主分子的晶体性质。这些现象促进了杂化纳米结晶技术的发展[22-27]，其初衷在于发展一种诊疗一体的药物递送技术，即将显影剂、配体或生物相容性聚合物杂化在药物的纳米结晶中，结晶的溶解使得配体和聚合物暴露于纳米结晶表面，进而实现长循环或靶向递送。显影剂则可示踪纳米结晶的体内转运过程及在疾病部位的变化情况（见图1）。除了荧光探针外，放射性核素或金属显影剂也可通过其对应的显像设备起到定位作用。

2.2 制备方法

杂化纳米结晶的制备可以采用传统的纳米结晶制备方法，即由上到下（top-down）或由下到上（bottom-up）工艺[28]，直接在制备过程中引入显影剂即可实现杂化。方便起见，杂化纳米结晶的制备多以由下到上工艺为主，即溶剂-非溶剂沉淀的方法，其基本过程为：根据显影剂的亲疏水性质，将其溶解在药物溶液中或非溶剂中，一定条件下使药物溶液与非溶剂混合，药物结晶析出并将显影剂杂化入晶格。比如，亲水性荧光分子FPR-749、荧光素和罗丹明B水溶性好，可溶解在水中作为非溶剂[23,29-30]；而亲脂性荧光分子DiD、DiR、Cy5等则溶解在药物的有机溶剂中[31-34]。荧光分子的大小和亲疏水等性质会影响其包载效率，但药物晶体中荧光分子的包载率通常较低，绝大多数小于1%，平均载量更是低于0.1%[23,30-31,33-34]。有限的荧光包载量使得杂化纳米结晶和纯药物纳米结晶具有相同的粒度、形态和结晶度，因此，从杂化纳米结晶中获得的研究结果可以反映药物纳米结晶的性质。由上到下工艺也可用于制备杂化纳米结晶，但一般需要先通过由下到上方法将荧光探针杂化到药物晶体中，再通过高压乳匀机等提供的机械力将杂化结晶打碎至理想的粒径[35]。

2.3 技术发展

2.3.1 第一代杂化纳米结晶 第一代杂化纳米结晶处于概念发展阶段，受到当时认知的局限，研究者往往使用常规的荧光探针（即其荧光性质不具有环境响应性）制备杂化纳米结晶。Zhao等[29]率先采用亲水性荧光分子FPR-749、荧光素和罗丹明B制备杂化纳米结晶，其优势在于可以通过过滤将未杂化的探针分子除去。此外Zhao等[29]对荧光探针的杂化量进行了考察，以荧光素为模型，发现不同杂化量的杂化纳米结晶都能发出荧光，但当杂化率为0.86%及以下时，杂化纳米结晶完全溶解时（对应0.002 mg · L-1及以下的荧光素水溶液）却不能发出荧光。据此，他们确定了荧光素的杂化量。也有研究者采用亲脂性荧光探针（如DiD、DiR、Cy5等）制备杂化纳米结晶[32-34]，相对于亲水性荧光分子，其在溶剂-非溶剂沉淀的过程中，未杂化的荧光分子本身也可能结晶析出形成纳米结晶，将其从药物杂化纳米结晶中分离出来却并不容易。

随着研究的不断深入，第一代杂化纳米结晶的弊端逐渐显露，主要在于所采用的荧光探针不具有环境响应性，无论是杂化于纳米结晶中还是由于结晶溶解而释放出来的探针均能发出荧光，基于这些荧光信号得到的结论可能造成误导。Hollis等[30]制备了3H标记紫杉醇杂化纳米结晶，通过活体成像观察荷瘤小鼠中杂化纳米结晶静脉注射后的荧光分布，同时通过闪烁计数测量紫杉醇的体内分布，发现药物的体内分布与荧光的分布存在差异，且这种差异随着时间推移更加明显。主要原因在于随着纳米结晶的溶解，更多的探针分子被释放出来，由于不具备环境响应性，这些探针分子仍然释放出荧光，由荧光信号得到的结果实际上反映了这些探针分子的体内分布情况，而探针分子与紫杉醇的理化性质上的差异造成了其体内行为及分布上的差异。

2.3.2 第二代杂化纳米结晶 为了准确地追踪纳米结晶的体内行为，关键问题在于如何区分杂化纳米结晶信号和游离探针分子的信号，这必然要求探针分子具有环境响应性[36]。聚集诱导发光（aggregationinduced emission, AIE）、ACQ和荧光共振能量转移（förster resonance energy transfer, FRET）等荧光探针具有独特的环境响应特性，杂化这些荧光探针的第二代杂化纳米结晶获得了“自我识别”能力[24-25,37-38]。

2.3.2.1 聚集诱导发光荧光探针基本原理 AIE是探针分子聚集后发出荧光的现象 。以典型的四苯基乙烯（tetraphenylethylene, TPE）分子为例，其分子中的4个苯环通过刚性的乙烯基连接，处于分子分散状态（如溶解在有机溶剂中）时，芳香基团可以旋转或扭转，激发态以热衰减的形式回到基态而不发出荧光；一旦TPE分子聚集（如形成沉淀），分子运动受阻，激发态的耗散只能通过光子发射来实现[40]。当把TPE分子杂化在药物纳米结晶中时，由于分子运动受到限制，能够发出荧光；一旦结晶溶解释放出TPE分子，若其能够保持溶解状态，则分子运动恢复，荧光淬灭[38]。相对于传统的探针分子，AIE可以有更大的使用量，因为探针分子间聚集反而可以增加荧光强度，不用担忧荧光淬灭的现象发生[41]。但其用量也不能无限制增加，过载也会导致和常规荧光基团类似的荧光衰减甚至完全淬灭[42]。需要注意的是，由于疏水性较强，纳米结晶溶解后释放的AIE分子可能沉淀析出，从而带来荧光干扰[43]。而且，AIE探针的发射波长通常小于600 nm，限制了其在体内研究的应用，目前主要用于细胞实验，研究纳米结晶与细胞间相互作用机制[41]。

2.3.2.2 聚集导致淬灭荧光探针基本原理 ACQ现象正好与AIE相反，其广泛存在于具有芳香共轭结构的荧光分子中，由于这些荧光分子具有强疏水性的平面结构，在水环境中易受到疏水力作用发生π-π堆叠，分子聚集导致荧光淬灭[44]。ACQ被普遍认为是荧光探针的缺点，并在新探针的研发中极力避免，但是，ACQ性质却在纳米粒的自我识别方面具有独特的优势。最近，一系列具有氟化硼二吡咯（BODIPY）或氮杂氟硼二吡咯（aza-BODIPY）母体结构的ACQ近红外探针在纳米粒的体内命运研究中崭露头角[45-54]。它们以分子形式包载于纳米粒的疏水骨架中时，可以发出强烈的近红外荧光，一旦骨架破裂，探针释放遇水，则发生分子间聚集，导致荧光完全淬灭。由于水在机体内无处不在，可以通过荧光信号准确地追踪纳米载体的体内转运过程[45-53]。类似地，这些ACQ探针也可以被用于实现纳米结晶的“自我识别”。但是，聚集的ACQ探针也可能在体内重新溶解于内源性的磷脂/胆盐胶束或囊泡，以及脂肪组织，从而出现荧光复现干扰检测。因此，采用ACQ荧光探针时往往需要设计探针的水溶液淬灭组作为对照，以评估荧光复现的强度。

2.3.2.3 荧光共振能量转移荧光探针基本原理 FRET是发生在供体分子荧光团和受体分子荧光团的非辐射能量转移现象。当供体分子的发射光谱与受体分子的激发光谱重叠，且2分子距离很近时，FRET效应发生，该效应的荧光强度与2个生色团之间的距离的6次方成反比[55]。因此，当FRET荧光对被包载于纳米载体中时，分子间距离较近，以供体分子激发光激发时，可以发出FRET荧光（FFRET），而一旦荧光对从纳米载体中释放出来，分子间距离增加，FRET效应消失，只能发出供体分子的荧光（F供体）。不同于AIE和ACQ的荧光消失，FRET通过发射光波长的转变实现纳米载体的“自我识别”。将DiO/DiI荧光对杂化于五味子甲酯纳米结晶，通过FFRET/F供体或FFRET/（FFRET+ F供体）的变化可实现对纳米结晶的细胞摄取、转运过程及胞内溶解动力学等的监测[40]。不过FRET的受体-供体体系对实验设计和后续分析提出了额外的挑战。为了实现定性和半定量纳米结晶的行为，需要谨慎挑选荧光分子对使FRET荧光稳定性最大化且具有一定强度，并保证2种生色团的荧光强度具有可比较性[56-57]。另一个挑战来自FRET荧光自身不够理想的环境稳定性和光稳定性[58-59]。不同波长荧光对的组织穿透能力差异对纳米结晶体内研究结果的准确性也存在一定影响[60]。

3 杂化ACQ探针纳米结晶体内命运研究进展

鉴于目前第二代杂化纳米结晶中，杂化AIE和FRET探针的结晶主要用于细胞实验，本部分介绍通过杂化ACQ探针研究纳米结晶体内命运的进展情况。

3.1 口服给药

将药物晶体粉碎至纳米尺度，可以显著增加其比表面积，进而显著促进难溶性药物的溶出和口服生物利用度。体外溶出和体内生物利用度的研究结果无不证明了这些特点，因而，人们推测纳米结晶口服后在体内迅速溶解[61-63]。但是，体外溶出条件与体内实际情况存在明显差异，比如，胃肠道的蠕动远远弱于体外溶出搅拌的剧烈程度，另外，胃肠道中的水分也极为有限，这些因素并不利于纳米结晶的迅速溶解。如果纳米结晶在胃肠道中可以滞留一定时间，则可能与小肠细胞产生相互作用。

Xie等[25]和Shen等[24]分别以杂化ACQ探针的环孢素A纳米结晶和槲皮素纳米结晶为模型进行了系列研究。2种药物杂化纳米结晶的溶出过程和荧光淬灭是一致的。图2展示了2种粒径（250和550 nm）环孢素A杂化纳米结晶体外溶出过程残余纳米结晶含量和残余荧光强度的经时变化曲线，相关性分析表明两者具有很好的相关性。因此，ACQ荧光信号可以准确示踪完整纳米结晶的体内转运过程。2种药物杂化纳米结晶灌胃给药后，其胃肠道中荧光滞留时间均长达12 ～ 18 h，表明纳米结晶口服后并不会迅速溶解。此外，口服后大鼠肝脏和肺部等主要器官均发现了荧光信号，这为杂化纳米结晶的整体吸收提供了强有力的证据。激光扫描共聚焦显微镜观察小肠组织的冷冻切片，通过ACQ探针信号，也证实了完整的纳米结晶可以跨小肠上皮细胞转运至基底侧。

3.2 注射给药

纳米结晶注射后的体内行为存在较大的争议。有研究者认为，由于具有较快的溶出速度，纳米结晶注射后在血中迅速溶解，呈现类似于药物溶液的动力学和体内分布特征[64-65]。也有学者认为纳米结晶注射后能够在一定时间内保持其结构完整性，可能被巨噬细胞迅速识别和摄取，从而在单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocyte system，MPS）的器官和组织蓄积[66-67]。

Wang等[35]将ACQ荧光探针杂化到姜黄素纳米结晶中，研究其注射后的体内行为。结果发现姜黄素纳米结晶注射进入人体48 h后血液中荧光存留量仍有9.0%±1.3%，表明纳米结晶注射后并不能够迅速溶解。同时在大鼠各个器官中均发现了ACQ荧光信号，其在各脏器中的滞留时间由长到短依次为：肝、肺、脾、肾、心和脑，但主要的分布器官为肝和肺，这二者中的荧光占了脏器总荧光的90%以上。另外，600 nm组的荧光强度几乎在所有器官中都显著高于300 nm组，究其原因，除了小粒径组溶出速率快以外，也说明大粒径结晶更易被MPS识别、吞噬。

3.3 滴眼给药

纳米结晶载药量高、刺激性低，巨大的比表面积也使其具有一定的生物黏附力，进而延长其在角膜的滞留时间，有利于药物在眼部渗透[68-69]。为了研究纳米结晶的眼部给药后命运，Liu等[53]将ACQ探针杂化于环孢素A纳米结晶，发现部分纳米结晶能以整体形式渗透进入角膜，不过在基质和内皮中观察到的荧光信号微乎其微，说明纳米结晶眼用制剂无法以整体形式穿透角膜，仅能作为药物贮库释放活性分子。

4 结语与展望

杂化纳米结晶不仅为纳米结晶的体内示踪提供了强有力的工具，也可以发展成为诊疗一体化的药物递送平台技术。荧光探针的杂化并不需要额外的处理，在纳米结晶制备的同时即可实现。由于药物晶格结构的限制，荧光探针的杂化量往往较低，虽然保证了纳米结晶的理化性质不受影响，但对探针分子的荧光量子效率提出了较高的要求。通过活体成像和激光共聚焦显微镜可以从动物活体、离体或细胞层面全面解析杂化纳米结晶的体内命运和作用机制。环境响应探针的使用为杂化纳米结晶的准确示踪提供了保障，但也需注意荧光复现等现象对结果的干扰。发展新型的环境响应探针，彻底避免荧光复现等干扰问题，才能完善杂化纳米结晶技术。值得注意的是，目前的研究以定性结果为主，如果能够通过荧光强度实现完整纳米结晶的定量测定，再结合药物分子的准确数据，基于这两点来定量描绘完整纳米结晶粒子和药物在机体内的时空命运，才能真正揭示纳米结晶制剂的体内命运，这也是杂化纳米结晶技术的重要研究方向。随着越来越多的难溶性备选化合物的发现，纳米结晶技术将具有更为广阔的应用前景，对于纳米结晶的体内命运及影响因素全解析，对于纳米结晶制剂的发展具有非常重大的指导意义。