加味启膈散抑制细胞增殖治疗Barrett食管作用机制研究

胡蓆宝， 田晶晶， 梁若冰， 袁红霞

Barrett食管(Barrett' s esophagus, BE )是指食管下段复层鳞状上皮被化生的单层柱状上皮替代的一种病理现象，可伴有或不伴有肠上皮化生，其中伴肠上皮化生者属于食管腺癌(Esophagealadenocarcinoma，EAC)的癌前病变[1]。伴随进食习惯改变，进食过量营养等生活习惯的变化，近年来EAC的发病率逐渐增长，尤其以西方国家显著，其发病率己超过了食管鳞癌[2]，在EAC患者中，接近90%有BE既往史[3]。现代医学对于BE的病因尚不完全明确，目前，尚未找到治愈BE的有效方法，现代医学治疗BE主要采用对症治疗和随诊，必要时可予内镜及手术治疗，对于近期解决临床症状疗效可，但远期疗效尚未得到有力的实验证实。因此，寻找有效合理的治疗BE的方法，对有效防治BE及EAC的二级预防具有重要的临床意义。近年来，中医药治疗BE逐渐受到医学界的重视，但目前对BE的病机认识尚未得到统一，药物作用及其机理和途径还未明确，限制了其临床应用及推广。本研究旨在通过检测Ki-67和PCNA蛋白表达以探索加味启膈散抑制细胞增殖对BE的治疗机制，为BE的临床治疗及EAC的二级预防提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级成年健康Wistar 大鼠72只，10周龄，雌雄各半，体重（220±20）g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002。于动物实验中心的标准化饲养房中饲养，自由摄食进水。自然昼夜，自然光照。室内通风，室温维持在18～22 ℃，相对湿度维持于40%～70%。

1.1.2 实验器材及试剂 烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司DHG-9140A），中性树胶（国药集团化学试剂有限公司），山羊血清（北京元亨）抗体稀释液（博士德 AR1016），盐酸左氧氟沙星注射液（江苏扬子江药业），右旋糖酐铁注射液（浙江天瑞药业）， PCNA、Ki-67免疫组化试剂盒（MDL-北京百奥思科生物医学技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及造模 全部动物以普通颗粒大鼠饲料常规适应性喂养1周，随机将其分为6组，每组12只大鼠，分别为正常组，模型组，中药全方组，中药行气活血组，中药理气化痰组，中药化痰祛瘀组。除正常组外，其余五组均采用改良后的“食管十二指肠端侧吻合加铁剂术”制备BE模型[4]，具体方法为：取上腹正中剑突下约0.5 cm处，纵行切开皮肤约2 cm，然后沿腹白线剪开肌层和腹膜，将胃提出，剪断肝胃韧带，显露食管，分离食管下段迷走神经及血管，丝线结扎贲门，用无创动脉夹夹闭食管上段，固定食管，从贲门上0.3 cm处切断食管；缝合贲门并荷包包埋入胃中，保留全胃；在距幽门1 cm处侧壁避开血管纵行切开十二指肠壁约0.5 cm，随后将食管下端全层与十二指肠切口行端侧吻合，吻合完毕后进行分层缝合。术后24 h禁食不禁水，术后3日内，每天每只大鼠腹腔注入盐酸左氧氟沙星注射液1.5 mg/kg。术后第2周给予铁剂，术后1天禁食不禁水，术后3天内每天注入适量左氧氟沙星（1.5 mg/kg）到腹腔，同时给予葡萄糖盐水自由饮用，术后14天注射右旋糖酐铁液，每周2次，每次30 mg/kg，持续31周。

1.2.2 加味启膈散及其拆方的制备 加味启膈散全方组：沙参10 g，砂仁10 g，荷叶10 g，生姜6 g，郁金10 g，厚朴10 g，紫苏10 g，茯苓10 g，川贝母10 g，清半夏10 g，丹参20 g，当归20 g，仙鹤草30 g。行气活血组（全方组去掉化痰药）：全方组去茯苓10 g，川贝母10 g，清半夏10 g；理气化痰组（全方组去掉祛瘀药）：全方组去丹参20 g，当归20 g，仙鹤草30 g；化痰祛瘀组（全方组去掉理气药）：全方去郁金10 g，厚朴10 g，紫苏10 g。药物选用北京康仁堂药业有限公司中药配方颗粒，将按照规定剂量的中药配方颗粒以适量开水充分溶解，得到0.66 g/mL浓度中药药液，折合成生药量为5.4 g/mL。按人与大鼠给药剂量换算，大鼠每日给药剂量为生药10 g/kg。

1.2.3 给药方法 31周造模成功，第32周开始，正常组及模型组大鼠，给予生理盐水1 mL/100g灌胃，每日2次，各治疗组大鼠分别给予相应药液10 g/kg灌胃，每日2次，连续给药14天后，处死并进行指标检测。

1.2.4 处死及取材 各组动物进行处死前，均予禁食1天不禁水，然后采用10%水合氯(0.3 mL/100g) 腹腔注射麻醉,自吻合口以上约0.5 cm处剪取1.0 cm长食管组织，4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋并切片。

1.2.5 观察指标及检测方法

1.2.5.1 一般状态观察 每天观察并记录各组大鼠体重、毛色、精神状态及进食情况。

1.2.5.2 细胞增殖相关指标测定 采用免疫组化法检测PCNA、Ki-67 蛋白表达。结果判断：Ki-67、PCNA 在细胞核中表达，以细胞核呈棕黄色至深棕黄色为 Ki-67、PCNA蛋白表达阳性。高倍视野（×400）下分别随机选取5个视野，每个视野计数200个细胞，观察阳性细胞百分比。按阳性细胞所占比例分为：阳性细胞≤5%或细胞无棕色颗粒的视为阴性，记为“-”；阳性细胞占5 %～25%为弱阳性，记为“+”；阳性细胞占26 %～50%的为阳性，记为“++”；阳性细胞占＞ 50%为强阳性，记为“+++”。

1.3 统计学分析 数据采用SPSS22.0 软件进行统计分析，计量数据通过均数±标准差描述，计数数据通过频数或率表示；多组间计量数据在满足正态分布要求条件下进行方差分析；等级资料比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较时采用Bonferroni 对P值进行校正。以P＜0.05判定为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 各组大鼠体重随周龄的变化而增加。于4周后，模型组、理气化痰组、行气活血组、化痰祛瘀组个别大鼠饮食量下降，活动度有一定降低；14周后观察发现毛发无光泽、颈部脱毛、精神状态差；全方组大鼠饮食量、活动度、毛发光泽度情况优于模型组、理气化痰组、行气活血组及化痰祛瘀组，且无脱毛现象。正常组大鼠实验过程中无死亡，模型组死亡3只，全方组死亡2只，行气活血组死亡4只，理气化痰组死亡5只，化痰祛瘀组死亡5只。对死亡大鼠进行解剖发现，4只死于吸入性肺炎、10死于弥漫性腹膜炎、5只死于吻合口狭窄。

2.2 各组大鼠Ki-67 蛋白表达 正常组中Ki-67蛋白的表达有1只为弱阳性；模型组中有8只为强阳性；理气化痰组中有6只为强阳性；行气活血组中有 5 只为强阳性；化痰祛瘀组中强阳性有4只。全方组中无强阳性，1只中等阳性，3只弱阳性，6只为阴性。组间方差分析结果显示各组的Ki-67 表达水平差异有统计学意义（H=43.181，P＜0.001）。进一步Kruskal-Wallis H检验显示，与正常组相比，全方组Ki-67表达水平无显著差异（P＞0.05），而其他治疗组与模型组的表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，全方组Ki-67表达显著降低（P＜0.05）；与全方组比较，理气化痰组和行气活血组大鼠的 Ki-67 表达水平较高（P＜0.05），而中药化痰祛瘀组与全方组间无显著差异（P＞0.05）。见表1，图1。

2.3 各组大鼠PCNA蛋白表达 正常组大鼠食管组织PCNA蛋白表达呈阴性；模型组中强阳性7只，中等阳性2只；理气化痰组中强阳性5只，中等阳性和弱阳性各1只；行气活血组中强阳性5只，中等阳性3只；化痰祛瘀组中强阳性3只，中等阳性4只；全方组中等阳性1只，弱阳性4只，阴性5只；正常组中均为阴性。组间方差分析结果显示各组PCNA表达差异有统计学意义（H=41.587，P＜0.001）；进一步Kruskal-Wallis H检验显示，与正常组比，模型组、理气化痰组、行气活血组和化痰祛瘀组PCNA表达水平均显著升高（P＜0.05），全方组和正常组间差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比，全方组PCNA表达水平显著降低（P＜0.05）；与全方组比，理气化痰组和行气活血组PCNA表达水平均显著升高（P＜0.05），化痰祛瘀组与全方组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2，图2。

表1 各组大鼠Ki-67 蛋白表达情况

图1 各组大鼠Ki-67 蛋白表达（免疫组化法，×400）

表2 各组大鼠PCNA蛋白表达情况

图2 各组大鼠PCNA 蛋白表达（免疫组化法，×400）

3 讨论

BE是指食管黏膜上皮化生的一种病理变化。临床上大多数BE患者常伴随有烧心、反酸、胸骨后痛等胃反流的基本症状，故中医将其列入到 “膈噎”的范畴。历代医家对其机制有不同的认识，《灵枢·上膈》：“气为上膈者”。《古今医统》针对膈噎进行论述的过程中，则是认为“必有死血。”而在宋代之前多数会基于寒和阴盛的角度来分析膈噎，《诸病源候论》之中记载的原因为：“阴阳不和，藏气不理”。在金代与元代的时候，则更多的基于阴虚阳盛的角度形成一定程度的认知，诸如朱丹溪在著述中提出：“偏助阳气，积成膈热”等。由此可见膈噎病因病机复杂。

课题组根据多年临床经验提出“痰、气、瘀互结于食道”为BE的发病之本，食道为胃所主，故“胃失和降”为病机关键。忧思过虑、饮食不节、阴精损伤或久病等因素，首先伤及脾气，脾伤则津液不布，聚而为痰，痰气交阻于食道；肝为风木之脏，主疏泄而藏血，其气升发，喜条达而恶抑郁，司情志；郁怒伤肝，肝失疏泄，气为血之帅，气郁则血停，瘀血阻滞于食道；痰、气、瘀互结于食道，食道为胃所主，胃失和降日久出现了膈噎的症状，从而发生BE。

启膈散出自《医学心悟》，现代医家根据“异病同治”理论，应用此方辨证论治反流性食管炎[5-6]、Barrett食管[7]、食管癌[8]等，均取得显著疗效。加味启膈散则是在启膈散的基础上加味而成。全方组成为沙参、川贝母、茯苓、砂仁、郁金、丹参、当归、半夏、厚朴、生姜、苏叶、荷叶、仙鹤草，为理气活血、化痰降逆之剂。其方证病机特点是痰气瘀互结，胃失和降。沙参甘凉润燥；川贝母苦辛泻降，清热化痰；合用滋润干槁之胃脘，调理气机阻滞，为君药。茯苓甘淡和中；砂仁沁香悦脾，有助于开胃；郁金活血疏肝，解除烦郁，达到良好的破瘀以及清心等效果；丹参可以实现活血化瘀和营等基本的疗效。当归活血养血，助丹参活血之功；以上诸药共奏利气开郁、活血化痰之功，合为臣药。方中半夏、厚朴、生姜、苏叶等药材取半夏厚朴汤之意，半夏化痰散结，降逆和胃；厚朴下气除满，助半夏散结降逆；生姜和胃止呕，制半夏之毒；苏叶芳香行气，理肺舒肝，助厚朴行气宽胸、宣通郁结之气；通过辛苦合用的治疗方式，辛以行气散结，痰涎得化，专治证属痰气交阻的梅核气，合为佐药。荷叶为轻清之品，其性平，升举清阳，可宣上焦阳气，升提胃气，于大队降肃之药中少佐可使升中有降，降中有升；仙鹤草收敛止血、消肿解毒，合为使药。全方共奏行气散结，化痰降逆，活血祛瘀，使郁气得疏，痰涎得祛，瘀血得化。配伍严谨，标本兼治，诸药配合合理，共成理气活血、化痰降逆，从而使胃腑得降，症状得解。

正常的食管鳞状上皮细胞大多数处于静止状态，仅部分基底层细胞有增殖能力。有研究[9]证明从正常食管到反流性食管炎到BE再到EAC，食管上皮的细胞增殖率依次逐渐增强。而目前反映细胞增殖常用检测指标有 PCNA和Ki-67。PCNA和Ki-67是与细胞增殖密切相关的核蛋白，可反映细胞增殖活性和肿瘤恶性倾向。

Ki-67作为一个细胞增殖的标志物，在细胞增殖周期的细胞核中表达，在 G0 期和G1早期不表达，G1中期到晚期出现，S期和G2期逐渐增加，M期达高峰，M期后迅速降解或丢失抗原决定簇。Ki-67具有半衰期短、阳性表达覆盖于整个有丝分裂期等优点，被认为是判断细胞增殖活性的重要参考指标[10-11]。有研究表明，Ki-67 表达高低与肿瘤的分化程度、转移和预后紧密相关[12]。既往研究[13]显示，在重度 RE和BE中Ki-67阳性率和表达强度相较于正常食管黏膜组织和一般的食管炎症均明显增高，提示 Ki-67的阳性表达在重度RE和BE的细胞增殖中有重要作用。因此，检测Ki-67对判断BE的发展及预后有一定的意义。

PCNA是DNA聚合酶的辅助因子，该蛋白主要聚集部位是细胞核，直接参与细胞增殖过程中DNA 复制，其在DNA合成的G1末期开始增加，在S期为最高峰，在G2期、M期含量明显降低，与细胞周期中DNA合成状态一致，是一种评价细胞增殖状态的敏感指标。有研究[14]结果表明PCNA在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁组织及食管正常组织，并且食管鳞癌组织中细胞增殖越活跃，细胞增殖能力越高，食管鳞癌组织的分化程度越低，临床分期越晚，其组织中的PCNA阳性表达率就会更高，说明在食管鳞癌的分化过程中PCNA是重要的参与者。还有很多研究发现在胃癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤组织等中PCNA阳性表达率也明显高于癌旁组织以及正常组织[15-17]。由此可见对 PCNA 进行组织学检测可以判断细胞增殖活性及肿瘤恶性程度，从而有助于判断疾病预后。

本研究发现，与模型组比，全方组大鼠PCNA表达水平明显降低，而全方组也不同程度地低于理气化痰组、行气活血组和化痰祛瘀组，说明加味启膈散可有效抑制PCNA表达，且全方组的效果优于各拆方组；正常组和全方组间大鼠的PCNA表达水平无明显差异；理气化痰组、行气活血组和化痰祛瘀组间也无明显差异。在 Ki-67 表达水平上，与模型组相比较，全方组大鼠的Ki-67 表达水平明显低于模型组，说明加味启膈散可有效抑制 Ki-67表达；而全方组也分别低于理气化痰组和行气活血组大鼠的Ki-67表达水平，与化痰祛瘀组大鼠的Ki-67 表达水平无明显差异，与正常组和全方组间大鼠的Ki-67表达水平无明显差异，说明全方组的效果优于理气化痰组和行气活血组。

综上所述，本实验发现加味启膈散全方能显著抑制大鼠BE模型的Ki-67及PCNA表达，作用分别优于各拆方组，提示加味启膈散可通过抑制BE时Ki-67、PCNA的过表达，从而抑制细胞过度增殖，起到对BE的治疗作用。