FoxO3基因在膀胱癌中的表达、功能富集和信号通路生物信息学分析

王德鑫， 齐 峰， 刘一鸣

叉头盒O类（Forkhead box protein O，FoxO）转录因子属于转录调节器叉头家族，该家族具有一个被称为“叉头盒”的DNA结合域，由FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6共4个成员组成[1]。FoxO参与多种细胞过程，如细胞周期调节、细胞凋亡和对活性氧的抵抗等[2]。有研究显示，这些转录因子作为肿瘤抑制因子发挥重要作用[3]。且FoxO3和FoxO4在乳腺癌和前列腺癌等多种实体肿瘤中呈现差异表达，并与肿瘤的临床病理特征和患者预后存在相关性[4-5]。

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，然而其确切发病的分子机制尚不十分清楚[6-7]。且部分患者术后常常多次复发，是导致治疗失败和患者死亡的重要原因。因此，在分子机制上探讨膀胱癌发生的分子机制、复发转移和预后分子标志物是目前研究的热点[8]。本研究采用生物信息学方法探讨FoxO3在膀胱癌中表达、相关生物学功能和信号通路，以及与患者生存期的关系。

1 资料与方法

1.1 FoxO3基因表达水平分析 在癌症基因组图谱数据库（TCGA）中分析FoxO3基因mRNA在膀胱癌患者肿瘤组织和对应正常膀胱组织中的相对表达水平，在TCGA数据库中检索“膀胱癌”和“FoxO3基因”，检索物种为人类，并分析FoxO3基因mRNA表达水平是否与患者临床病理特征及患者预后存在相关性。

1.2 FoxO3基因及相关蛋白网络构建 STRING数据库(http://string-db.org/cgi/input.pl)[9]对FoxO3及相关基因编码蛋白进行蛋白-蛋白相互作用网络构建，物种选择人，作用蛋白不少于50个，相互作用关系置信度大于0.7。

1.3 基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析 采用David数据库进行GO功能富集和和信号通路分析。GO功能富集包括细胞定位富集、分子功能富集和生物学过程富集，并采用气泡图进行表示，反映相关基因的功能、基因技术、基因比例及P值。

1.4 生存分析 根据FoxO3基因基因mRNA表达中位数将膀胱癌分为高表达组和低表达组，Cox回归模型log-rank检验比较高、低表达组膀胱癌患者的总生存期（OS）和无疾病进展生存期（DFS）有无差异，并计算风险比（Hazard ratio, HR）。

1.5 统计学处理 差异表达、蛋白网路等采用在线软件分析，hub基因筛选采用cytocscape进行，生存数据采用Cox回归模型的log-rank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FoxO3基因在膀胱癌组织中的表达 与对应的正常膀胱组织比较，FoxO3基因在膀胱癌组织中的表达显著降低（图1A），而FoxO3表达水平在不同膀胱癌分期中无明显差异（图1B）。

2.2 PPI分析及hub基因筛选 STRING数据库构建FoxO3蛋白相互作用网络（图2A），FoxO3蛋白-蛋白相互作用网络中共有51个蛋白和587个相互作用关，各蛋白平均相互作用指数为23，网络中各个蛋白富集明显。Cytoscape筛选蛋白网络中的关键基因（hub基因），FoxO3、TP53、AKT1、FoxO1、FoxO4、CTNNB1、MAPK3、MAPK1、SIRT1和STAT3为蛋白网络中的关键基因（图2B）。10个关键基因相互作用关系紧密（图2C），且呈现明显的聚类表达（图2D）。

2.3 功能富集 FoxO3编码蛋白主要定位于细胞核，分子生物学功能主要为酶和蛋白结合，生物学过程主要为信号调控。而相关信号通路主要富集于癌症相关信号通路如PI3K-Akt 信号通路等，见图3。

2.4 相关性分析 FoxO3基因表达与FoxO3B基因表达呈正相关（r=0.94,P＜0.05），而与TIMM16基因表达呈负相关（r=-0.43,P＜0.05），见图4。

2.5 生存分析Log-rank检验显示FoxO3低表达组膀胱癌患者的总生存期（HR=1.4,P=0.029）和无疾病进展生存期（HR=1.5,P=0.015）显著高于高表达组膀胱癌患者，见图5。

图1 FoxO3基因在膀胱癌组织中的表达及其与患者临床分期的关系

图2 FoxO3基因PPI分析及hub基因筛选

图3 FoxO3基因及网络蛋白功能富集和信号通路分析

图4 与FoxO3基因表达相关基因的散点图

图5 FoxO3基因表达水平与膀胱癌患者预后的生存曲线

3 讨论

膀胱癌是发病率仅次于前列腺癌的第二种泌尿生殖道恶性肿瘤，每年新发病例超过33万例，死亡人数超过3万例[10]。膀胱癌发生与吸烟、暴露在芳香胺中以及肿瘤家族史密切相关[11]。首次诊断为非肌肉浸润性膀胱癌的患者中，80%的患者预后较好，但此类患者术后复发风险仍然很高，且部分患者反复复发后可进展为肌肉浸润性膀胱癌[12]。另外有20%的膀胱癌患者肿瘤侵犯基层和浆膜层，预后较差，死亡率较高[13]。

虽然其确切机制尚不清楚，但膀胱癌发生发展与染色体异常、表观遗传变化以及多基因表达异常有关。FoxO3是FoxO转录因家族重要成员之一，FoxO3受P13KPKB/c-Akt信号通路调节，该信号通路磷酸化可导致FoxO失活，从而导致FoxO3表达水平降低。多篇文献报道，FoxO3在多种肿瘤包括前列腺癌[14]、结直肠癌、胰腺癌等[15]肿瘤组织中呈现低表达，且与患者的预后存在一定的关系。还有研究认为FoxO3高表达与肝癌的化疗抵抗有关[16]。因此，FoxO3可能在多种实体肿瘤的发生发展及预后中发挥重要作用。

FoxO3在膀胱癌中的表达、生物学功能、信号通路及其与患者预后关系的研究报道不多。Wang等[17]采用免疫组化方法探讨了FoxO3和FoxO4表达与膀胱癌临床病理特征和预后的关系。研究认为FoxO3和FoxO4的表达与膀胱癌患者的临床病理学特征和预后有关[17]。本研究采用生物信息学方法检索TCGA数据库中关于FoxO3在膀胱癌患者癌组织和正常膀胱组织中的表达水平并进行比较，结果提示FoxO3在膀胱癌组织中表达水平明显下调，而这种下调水平在不同分期的膀胱癌组织中是一致的，说明FoxO3下调是膀胱癌早期事件，且不随疾病的进展而改变。研究还认为FoxO3编码蛋白主要定位于细胞核，分子生物学功能主要为酶和蛋白结合，生物学过程主要为信号调控。而相关信号通路主要富集于癌症相关信号通路如PI3K-Akt信号通路等。上述分子功能和信号通路符号膀胱癌发生发展的分子机制。提示FoxO3可能成为膀胱癌靶向药物研发的潜在靶点。生存分析提示，FoxO3低表达组膀胱癌患者的总生存期（HR=1.4,P=0.029）和无疾病进展生存期（HR=1.5,P=0.015）显著高于高表达组，说明FoxO3高表达是膀胱癌患者预后不良的危险因素，FoxO3可能成为膀胱癌患者预后的分子标志物。