MicroRNA-133a-5p调控c-met表达对胆管癌细胞迁移和侵袭的影响

杨 波， 刘小方

胆管癌是一种病死率极高的高度侵袭性胆道恶性肿瘤，它起源于胆管上皮细胞，起病隐匿，进展迅速，早期诊断困难，对常规放射治疗和化疗不敏感，手术切除率低，术后复发率高[1-3]。临床上大多数胆管癌患者在确诊时已属于晚期，这与其早期即发生肿瘤浸润迁移以及高度侵袭性有关[4]。因此，研究其致病机制，寻找新的诊断及治疗方法尤为重要。

MicroRNA(微小RNA，miRNA)是一种约包含21～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，广泛存在于真核生物中，作为基因表达的转录后调节因子，在各种生物过程中发挥关键作用，包括代谢、细胞增殖、凋亡、分化、转分化和细胞信号传导[5-6]。miR-133作为其中一个亚型，广泛参与多种肿瘤的发生发展过程[7]。近年来多项研究结果表明多种miRNA在胆管癌中异常表达，在癌细胞的迁移侵袭中发挥重要作用[8-9]。

本研究旨在通过研究MicroRNA-133在胆管癌QBC939细胞系中的表达，进一步探讨MicroRNA-133对胆管癌细胞迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 高糖DMEM培养液、胎牛血清购自美国Corning公司，Trizol试剂盒购自上海普飞生物科技有限公司，M-MLV试剂盒购自美国Promega公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，MicroRNA PCR引物购自武汉擎科创新生物科技有限公司，miR-133抑制物（AntimiR-133a-5p）、无关miRNA寡核苷酸均购于广州锐博生物科技有限公司，Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国赛默飞世尔公司，Transwell小室购于美国Costar公司，基质胶Matrigel购于美国BD公司。

1.2 细胞及其培养 胆管癌细胞株QBC939购自上海吉凯基因公司，用高糖DMEM培养液（含10%胎牛血清、2 mmol/LL-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)，在37 ℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内常规传代培养。选择收集对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 细胞样本RT-PCR分析 细胞样本用Trizol试剂盒提取细胞中总RNA，使用M-MLV试剂盒进行RNA反转录得cDNA，进行实时荧光定量PCR仪检测miR-133表达量。根据Hsa-miR-133基因信息，运用Primer 5.0分别设计引物，以U6作内参基因（序列见表1）。每个样本重复检测3次。目的基因的相对表达量采用2－ΔΔCt值表示。根据RT-PCR结果，选择miR-133b、miR-133a-3p、miR-133a-5p不同成熟体中表达最高的成熟体进行后期的干扰实验。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.4 实验分组及转染 将细胞分为3组，分别是（1）干扰组：Anti-miR-133a-5p转染组；（2）阴性对照组：转染无关序列组；（3）空白对照组：自然生长组。干扰组及阴性对照组分别给予Anti-miR-133a-5p和无关miRNA寡核苷酸，运用脂质体转染剂Lipofection 2000进行转染，转染方法参照说明书。转染后48～72 h收集各组细胞用于后续实验。

1.5 荧光定量RT-PCR检测 转染后收集各组细胞进行检测，检测基因包括miR-133a-5p、酪氨酸激酶（c-met）。收集各组细胞使用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，使用M-MLV试剂盒进行RNA反转录得cDNA，进行实时荧光定量PCR仪检测miR-133a-5p、c-met基因在各组中的表达量。所用miR-133a-5p RT引物、U6 RT引物同前，U6用作内参决定相关miRNA的表达水平。目的c-met基因,上游引物序列为：5’-CAGCTCATAGGTAG AGCAAAGAAAGGGTGGGAT-3’,下游引物序列为：5’-AGCTATTACAATCCAAATATTGCCGTTTC ATAAAT-3’，内参GAPDH基因，上游引物序列为5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列为：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’,目的基因的相对表达量采用2－ΔΔCt值表示。

1.6 Transwell小室法检测细胞迁移与侵袭 在迁移实验测定中，取对数生长期的各组细胞，胰酶消化，用无血清培养基重悬细胞，并接种于Transwell小室（美国Costar公司）的上室中，下室中加入含10%胎牛血清的培养液500 μL，温育24 h后收集小室，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，4%多聚甲醛固定30 min，然后用0.1%结晶紫染色30 min。使用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，各组随机选取5个视野于显微镜下拍照并计数。实验重复3次。

在侵袭实验测定中，用基质胶Matrigel（美国BD公司）与无血清培养基以1：5稀释包被Transwell小室底部膜的上室面。取对数生长期的各组细胞，胰酶消化，将5×104个细胞重悬于无血清培养基并置于上室中，下室中加入含20%胎牛血清的培养液600 μL，温育48 h后收集小室，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，4%多聚甲醛固定30 min，然后用0.1%结晶紫染色30 min。使用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。各组随机选取5个视野于显微镜下拍照并计数。实验重复3次。

1.7 统计学分析 所有实验统计数据以均数±标准差表示，采用GraphPad Prism6.0软件进行统计学分析。多组之间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光定量RT-PCR检测结果

2.1.1 miR-133不同成熟体的表达 RT-PCR检测 miR-133b、miR-133a-3p、miR-133a-5p 在QBC939细胞中的表达量分别为0.74±0.07、0.99±0.12、1.00±0.06， 与 miR-133b，miR-133a-3p相比，miR-133a-5p的表达量最高，差异有统计学意义（P＜0.05，图1），所以选择miR-133a-5p进行后期的干扰实验。

图1 不同成熟体miR-133b、miR-133a-3p、miR-133a-5p在胆管癌QBC939细胞中的表达(aP＜0.05)

2.1.2 抑制miR-133a-5p表达后对胆管癌QBC939细胞中miR-133a-5p、c-met表达的影响 miR-133a-5p在干扰组胆管癌QBC939中的相对表达量为0.70±0.08，显著低于阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。肿瘤相关基因c-met在干扰组胆管癌QBC939细胞中的相对表达量为0.09±0.02，显著低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 2。

图2 miR-133a-5P、c-met分别在干扰组、阴性对照组、空白对照组中的表达情况（aP＜0.05，aaP＜0.01）

2.2 Transwell小室法迁移和侵袭实验结果

2.2.1 迁移实验检测结果 干扰组、阴性对照组和空白对照组穿过小室膜的细胞数分别为（69.5±8.3）、（110.0±5.3）和（109.3±11.2）个，与阴性对照组和空白对照组相比，干扰组穿过小室膜的细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01，图 3)。

图3 Transwell小室检测miR-133a-5p对胆管癌QBC939细胞迁移能力的影响(aaP＜0.01)

2.2.2 侵袭实验检测结果 同一批处理的细胞在铺Matrigel侵袭小室实验中呈现了相同的趋势，干扰组、阴性对照组和空白对照组穿过铺有Matrigel小室膜的细胞数分别为（19.3±3.3）、（65.3±2.6）和（83.0±5.3）个，与阴性对照组和空白对照组相比，干扰组的细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图4。

图4 Transwell小室检测miR-133a-5p对胆管癌QBC939细胞侵袭能力的影响(P＜0.01)

3 讨论

MicroRNAs是一类广泛存在于真核生物中的高度保守的非编码RNA，在转录后水平起作用并调节各种细胞过程，并且miRNA的上调或下调可影响各种蛋白质的表达，通过促进增殖和侵袭参与肿瘤发生[10]。研究表明，一些miRNA积极参与与致癌作用相关的重要过程，并在许多人类癌症中异常表达并作为致癌基因发挥作用[11-12]。而且中医药也可参与调控miRNA在肿瘤中的作用，有报道miR-7介导养正散结汤含药血清靶向于EGFR调控胃癌MKN-45细胞的增殖和凋亡[13]。姜黄素可通过调节miR-133a-3p靶向负性调控MMP15的表达而抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭并且诱导凋亡[14]。ciRS-7竞争性结合miR-7上调FAK的表达从而促进宫颈癌的増殖、侵袭及迁移，而中药单体紫草素可通过抑制FAK通路抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移[15]。中西医联合治疗晚期非小细胞肺癌的差异miRNA表达谱中，包括miR-21-5p、miR-182-5p、miR-382-5p在内的差异miRNAs有望成为中西医联合治疗晚期非小细胞肺癌疗效监测和预测分子标记物[16]。华蟾素可能通过Fas、caspase-3 mRNA的表达上调促进胆管癌细胞QBC939凋亡[17]。随着miRNA在中医药防治癌症研究中的应用不断扩大，miRNA调控机制为中医药治疗癌症的分子机制研究提供了一个新的视角,也为临床中西医结合研究及治疗癌症提供可行的思路和理论依据。因此，MicroRNAs可能成为肿瘤诊断和预后评估的生物标记物。

胆管癌是一种高度恶性的肿瘤，其发病率和死亡率在世界范围内不断增加[18]。由于其发病隐匿，早期发生的区域淋巴结和远处转移是其预后不良的主要原因之一[19]。为了确定新的治疗策略，有必要了解胆管癌发展的机制。已经发现某些miRNA的异常表达与胆管癌的发展相关，如miR-21[20]、miR-122[21]、miR-144[22]等。此外本课题组前期研究发现miR-224在体外有对胆管癌细胞抗凋亡及促进增殖的作用[23]。而microRNA-133与多种疾病的发生发展和肿瘤的迁移侵袭有关，在原发性肝癌[24]中，miR-133a的过表达可通过TGF-β/ Smad3信号通路抑制肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭。在胆囊癌[25]中，miR-133a-3p直接负调控重组信号结合蛋白Jκ（RBPJ）的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖以及迁移和侵袭能力。在胰腺癌[26]中，miR-133a通过负调节泛素特异性蛋白酶39（USP39）的表达发挥抑癌作用。在胃癌[7]中，miR-133a通过下调ERBB2及其下游信号分子p-ERK1/2和p-AKT的表达来抑制胃癌细胞的增殖。

胆管癌的转移性是影响其治疗和预后的一大主要原因，而细胞的迁移和侵袭是判断其转移能力的一个关键表型[27]。有研究表明，肿瘤的迁移侵袭过程涉及多种miRNA的表达异常[28]。本研究将实验对象选择为miRNA-133（序列为：上游：5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’， 下游 5’-UAAACCAAGGUAAAAUGGUCGA-3’），利用实时荧光定量PCR技术测定分析miR-133及其不同成熟体在胆管癌QBC939细胞中的表达，结果发现其中miR-133a-5p的表达量最高。使用特异抑制剂（Anti-miR-133a-5p）转染胆管癌QBC939细胞后，发现胆管癌QBC939细胞中内源性miR-133a-5p表达量明显降低，说明在胆管癌细胞系中转染特异性抑制剂后可以抑制内源性的miR-133a-5p的表达。随后检测miR-133a-5P对胆管癌细胞迁移侵袭的影响，发现miR-133a-5p表达量明显降低后，胆管癌细胞的迁移和侵袭能力均受到明显抑制，说明抑制miR-133a-5p的表达能明显抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭，因此miR-133a-5p的低表达可以明显改善胆管癌的恶性表型。从而说明miR-133a-5p在胆管癌迁移侵袭过程中发挥着类似癌基因的重要调控作用。但其具体参与和诱导迁移侵袭进程的分子作用机制还有待于进一步的实验论证和深入研究。

c-met是肝细胞生长因子（HGF）的受体，前期研究发现其在胆管癌发生发展中发挥很重要的作用，与HGF结合后，c-met催化结构域中的Tyr-1234和Tyr-1235残基被磷酸化并且受体被激活[29]。一旦被激活，c-met激活多个下游信号传导途径（例如PI3K/Akt和MEK/ERK途径），通过这些下游途径，HGF/c-met控制许多重要的细胞反应，包括肿瘤细胞增殖、分化和迁移[30]。在胆管癌细胞中，c-met信号传导在启动侵袭和触发转移中起重要作用[29]。研究表明miRNA作为一种重要的转录后调控因子，可对肿瘤相关基因c-met进行调控，从而影响肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭[31]。本实验中利用RT-PCR检测发现抑制胆管癌QBC939细胞系中miR-133a-5P后，肿瘤相关基因c-met表达也明显降低，说明在胆管癌QBC939细胞系中miR-133a-5P对于c-met表达可能有调控作用，目前尚不能确定c-met是miR-133a-5P的直接作用靶点，因此miR-133a-5P如何影响c-met表达的具体调控机制，在未来的研究中需要进一步深入探讨。

综上，miR-133a-5p在胆管癌中的表达上调，而抑制miR-133a-5p的功能可以抑制胆管癌的迁移侵袭能力，并减弱癌基因c-met的表达，提示miR-133a-5p有可能成为胆管癌诊断的一个新的分子标记物，有希望成为临床基因靶向治疗的新作用靶点以及胆管癌预后评估的一项新指标。