靶向多肽功能化阳离子聚合物携载ZNF580质粒对内皮细胞增殖的影响

朵兴红， 姜萧韩， 周若琦， 冯亚凯， 刘 晶

(1. 青海民族大学化学化工学院，西宁 810007； 2. 天津大学化工学院，天津 300072； 3. 青海民族大学生态环境与资源学院, 西宁 810007；4. 青藏高原资源化学与生态环境保护国家民族事务委员会重点实验室， 西宁 810007)

阳离子聚合物作为非病毒载体递送外源目的基因，在基因递送系统研究领域备受关注[1-2]. PDMAEMA是一种典型的、具有良好生物相容性的阳离子聚合物，PDMAEMA与DNA形成的基因复合胶束，具有卓越的内涵体逃逸能力及细胞内分解能力，细胞转染效率较高[3]. 在PDMAEMA链段上接入不同结构的PEG能够有效提高PDMAEMA/DNA复合胶束的稳定性，降低复合胶束的细胞毒性，但是依然没有提高转染效率[4-6]. 由于PDMAEMA/DNA复合胶束在血清条件下稳定性差，因此需要通过对其结构进一步改进，提高复合胶束的稳定性，降低细胞毒性，从而达到提高转染效率的目的.

为了增强基因复合胶束的稳定性，在本文前期的研究[7]中，以低聚倍半硅氧烷(POSS)为内核制备出具有良好生物相容性的八臂星型梳状共聚物 POSS-(PDMAEMA)8-PPEGMA，并在 PEGMA末端引入双键，用来连接 CAG-TAT-NLS多肽，得到 POSS-DP-CAG-TAT-NLS阳离子聚合物. 携载pEGFP-ZNF580 (pDNA)质粒自组装形成POSS-DP-CAGW/pDNA基因复合胶束. 细胞实验结果表明，该基因载体具有较高的转染能力. 本文在此基础上制备以POSS为骨架的星型阳离子聚合物POSS-(PDMAEMA)8(缩写为PPD)，在阳离子聚合物末端接枝梳状PEGMA引入双键，将CREDVW(Cys-Arg-Glu-As-Val-Trp)多肽键接在PPD阳离子聚合物末端，最终制备得到POSS-(PDMAEMA)8-PPEGMA-CREDVW(缩写为PPD-CREDVW)阳离子聚合物. 在水溶液中按不同n(N)/n(P)(氮磷元素的物质的量之比)携载pDNA质粒，自组装获得PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束，通过细胞实验考察PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束的载基因性能和细胞毒性，同时探索该基因复合胶束对EA.hy926细胞增殖的影响.

1 实验部分

1.1 主要试剂及仪器

试剂：甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、二甲基亚砜(DMSO)均为分析纯，购于阿拉丁化学有限公司. 八氨基笼状聚倍半硅氧烷(POSS)购于美国Hybrid Plastics公司授权总代理商长沙巴溪仪器有限公司. CREDVW(序列：Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp)购于上海吉尔生化科技有限公司.

仪器：DZF-6020型真空干燥箱(巩义市英峪高科仪器厂)；DF101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪高科仪器厂)；电热恒温干燥箱(天津市天宇实验仪器有限公司)；核磁共振仪(INOVA型，美国VARIAN)；旋转蒸发仪(巩义市英峪高科仪器厂).

1.2 PPD-CREDVW的制备

PPD-CREDVW的制备分5步进行：(1)制备星型POSS-Br8引发剂；(2)采用原子转移自由基聚合(ATRP)反应，以POSS-Br8引发DMAEMA聚合制备星型阳离子聚合物POSS-(PDMAEMA)8(PPD)；(3)制备POSS-(PDMAEMA)8-PPEGMA(PPD-PPEGMA)星型梳状聚合物；(4)PPD-PPEGMA星型聚合物末端引入双键制备POSS-(PDMAEMA)8-PPEGMA-DAs(PPD-PPEGMA-DAs)聚合物[7]；(5)在培养皿中加入5 mg/mL PPD-PPEGMA-DAs聚合物溶液，加入几滴三乙胺，再加入DMPA(4.3 mg) 和CREDVW多肽(多肽与聚合物的物质的量之比为16∶1)，在N2氛围下用紫外光照射10～15 min，最后过虑收集PPD-CREDVW聚合物溶液，通过截留相对分子质量为3 500的透析袋提纯12 h，透析后冷冻干燥得到PPD-CREDVW聚合物固体产物.

1.3 聚合物胶束的制备

配置5 mg/mL的PPD-CREDVW阳离子聚合物DMSO溶液，溶液通过0.45 μm的有机滤膜，在搅拌状态下缓慢滴入10 mL 磷酸缓冲盐(PBS)溶液中，用截留相对分子质量为3 500的透析袋透析除去DMSO溶剂，得到PPD-CREDVW聚合物胶束. PPD聚合物胶束采用同样的方法制备.

1.4 载基因纳米粒的制备

按照n(N)/n(P) 比为0.5、1、2、5、10、15、20，在2 mg/mL共聚物胶束中加入pDNA质粒(50 mg/mL)，经过30 min卵育得到不同n(N)/n(P)的PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束. 采用同样的方法制备PPD/pDNA基因复合胶束.

1.5 聚合物胶束与基因复合胶束ζ电位的测定

利用动态光散射技术(DLS)测定PPD聚合物胶束和PPD-CREDVW聚合物胶束的ζ电位，同时测定不同n(N)/n(P) 比时PPD-CREDVW/pDNA和PPD/pDNA基因复合胶束的ζ电位.

1.6 凝胶电泳实验

琼脂糖凝胶电泳实验用来考察复合胶束对pDNA质粒的压缩阻滞能力[8]. 本文考察不同n(N)/n(P)比(0.5、1、2、5、10、15)的PPD-CREDVW/pDNA和PPD/pDNA基因复合胶束，对pDNA质粒的压缩阻滞能力，具体实验步骤可参考本文的前期研究[9].

1.7 细胞毒性实验

聚乙烯亚胺(PEI)因其独特的“质子海绵体效应”具有与病毒载体最为接近的转染效率，被誉为非病毒基因载体的“金标准”[10]. 以PEI (1.8 kDa)/pDNA 和PEI (25 kDa)/pDNA作为对照，通过 MTT 实验考察PPD-CREDVW/pDNA和PPD/pDNA 基因复合胶束的细胞毒性，具体实验步骤可参考本文的前期研究[9]. 利用酶联免疫检测仪读取96孔板中各孔在490 nm 波长下的吸光度(OD). 利用如下公式计算细胞存活百分数(Relative Cell Viability,vr).

(1)

其中，OD′为复合胶束或基因复合胶束实验组减去调零组的吸光度；avg(ODC′)为矫正后的对照组吸光度平均值.

1.8 细胞转染实验

以PEI (25 kDa)/pDNA基因复合胶束为对照组，考察PPD-CREDVW/pDNA和PPD/pDNA基因复合胶束对EA.hy926内皮细胞的转染效果，具体实验步骤可参考本文的前期研究[9].

1.9 细胞摄取实验

采用PPD和 PPD-CREDVW聚合物胶束携载Cy5荧光染料标记的pDNA质粒，以PEI(1.8 kDa )和 PEI(25 kDa)为对照转染EA.hy926细胞，在培养4 h后，用PBS溶液清洗细胞3次. 细胞经胰蛋白酶消化后反复多次离心. 最后用流式细胞仪对PPD-CREDVW/pDNA和PPD/pDNA基因复合胶束的细胞摄取率进行分析. 具体实验步骤可参考本文的前期研究[11].

2 结果与讨论

2.1 PPD-CREDVW的合成机理与表征

PPD阳离子聚合物与PEGMA进行ATRP反应得到PPD-PPEGMA聚合物(图1). PEGMA末端的羟基用丙烯酰氯酯化得到含有末端双键的PPD-PPEGMA-DAs聚合物. PPD-PPEGMA-DAs和CREDVW多肽通过巯基-双键化学反应形成PPD-CREDVW阳离子聚合物.

图1 PPD-CREDVW星形聚合物的合成过程示意图

以氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)为溶剂，测得PPD-CREDVW产物核磁氢谱如图2所示，与N直接相连的2个-CH3的特征峰出现在δ=2.27处(j点)，并且酯基之后的-CH2-的特征峰出现在δ=4.18处(g、l点). 另外，在δ=0.8～1.2处出现的峰是与季碳原子相连的-CH2-特征峰(h、n点)，δ=1.7～1.9是与季碳相连的-CH2-的峰(i、m点). 最后，与叔胺相连的-CH2-其峰位置在δ=2.6处(f点)，与之相连的2个甲基峰出现在δ=2.51处(j点).

本文设计的多肽，除了保持 REDV(Arg-Glu-As-Val)序列之外，在REDV多肽一端引入-SH另一端引入色氨酸(Tryptophan，W)，即肽序列为Cys-Arg-Glu-As-Val-Trp. -SH的引入是为了与双键发生反应. 图2中t峰的出现说明CREDVW多肽接枝成功. 引入色氨酸是因为色氨酸分子结构中含有吲哚基团，在波长350 nm处显示特定的荧光强度[12]，可通过测定吲哚基团的荧光强度，测定多肽的接枝情况. 如图3所示，透析后PPD聚合物胶束在波长350 nm 处没有峰，而CREDVW多肽功能化修饰的PPD-CREDVW聚合物胶束在波长350 nm处有明显的峰，这进一步说明多肽已成功接枝在PPD聚合物末端. 根据标准曲线方程(y=3 469.7C+15.8，R2=0.999 7)定量计算PPD-CREDVW聚合物胶束中多肽接枝量(约0.75 mg/mL).

图2 DMSO-d6中PPD-CREDVW聚合物的结构与核磁共振氢谱

图3 透析后PPD、PPD-CREDVW聚合物胶束的荧光光谱

Figure 3 The fluorescence emission spectra of PPD and PPD-CREDVW polymer micelles after dialysis

2.2 聚合物胶束与pDNA基因质粒的结合能力

通过凝胶琼脂糖实验考察PPD-CREDVW和PPD聚合物胶束对pDNA质粒的阻滞能力，体现携载基因的能力(图4).

图4 不同n(N)/n(P)的基因复合胶束的电泳图像

Figure 4 The gel retardation assay picture of gene complexe micelles at differentn(N)/n(P) ratios

由于基因表面带有负电荷，可在电泳实验的电场作用下，迁移形成明亮的荧光条带. 随着n(N)/n(P)增大，基因复合胶束表面所带正电荷的不断增加，pDNA基因质粒的负电荷被中和，使电泳条带坍塌消失(图4A). PPD-CREDVW聚合物胶束与pDNA基因质粒形成致密的基因复合胶束，此时凝胶中不再出现荧光条带(图4B). 当n(N)/n(P)=10时，PPD聚合物胶束能够完全阻滞基因的迁移，形成稳定的PPD/pDNA基因复合胶束；当n(N)/n(P)=5时，PPD-CREDVW聚合物胶束能够完全阻滞基因迁移，不再出现荧光条带，形成PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束.

2.3 聚合物胶束与携载基因复合胶束的形态

PPD和PPD-CREDVW空白聚合物纳米胶束的粒径和ζ电位如表1所示. 聚合物胶束在携载pDNA基因质粒之前的粒径分别为160.35±13.60 nm和185.69±5.68 nm，ζ电位分别为20.56±1.42 mV和21.96±2.18 mV.

表1 聚合物胶束的粒径、ζ电位和多分散系数Table 1 The size, ζ potential and polydispersion of polymer micelles

注:PDI为多分散系数.

携载pDNA基因质粒后，测试PPD-CREDVW/pDNA和PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束的粒径和ζ电位(图5). 当n(N)/n(P)=5时，PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束的粒径为125.67±3.31 nm、ζ电位为10.64±1.65 mV. PPD/pDNA基因复合胶束的粒径为120.66±4.31 nm、ζ电位为8.65±1.35 mV. 随着n(N)/n(P)的增大，基因复合胶束的粒径减小，ζ电位增大，这可能是因为阳离子聚合物所带的正电荷与DNA表面的负电荷发生静电作用，使复合胶束结合更为紧密. 随着n(N)/n(P)的增大，基因复合胶束的粒径有所降低，说明基因复合胶束的结构更为紧实. 文献[13]研究表明：粒径为100～200 nm 的基因复合胶束有利于基因转染和细胞摄取，因此可以判断PPD/pDNA和PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束可作为基因转运载体，有利于细胞的内吞作用和有效的基因转染.

图5 基因复合胶束的粒径和ζ电位

2.4 基因复合胶束的细胞相容性

载体能够成功转运基因，并达到较高的细胞转染效率，其首要条件是载体必须具有较低的细胞毒性[13]. 在分子量相同时，星形聚阳离子表现出比线形聚阳离子更高的转染效率和更低的毒性，结构也易于设计，但星型阳离子聚合物电荷密度较高，导致了较高的细胞毒性[3,14]. 多面体低聚倍半氧硅烷由于结构紧凑、高度对称，能有效降低与内环境中组织的非特异性相互作用，具有良好的生物相容性[15-16]. 以PEI(1.8 kDa)/pDNA和PEI(25 kDa)/pDNA基因复合胶束作为对照组(图6)，选用EA.hy926内皮细胞进行MTT实验，考察不同浓度PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束和PPD/pDNA基因复合胶束的细胞毒性. 结果表明：与PEI(1.8 kDa)/pDNA基因复合胶束相比，细胞毒性无明显改变. 但是，随着胶束质量浓度的升高，与PEI(25 kDa)/pDNA基因复合胶束相比，PPD/pDNA基因复合胶束和PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束的细胞毒性显著降低，在各质量浓度下细胞存活率均在80%以上，低毒性更有利于实现有效的基因转染.

图6 不同质量浓度基因复合胶束作用于EA.hy926细胞的相对细胞活力

Figure 6 The relative viability of EA.hy926 cells treated with different mass concentration gene complexe micelles

2.5 基因复合胶束的细胞转染

由于ZNF580基因的表达与血管内皮细胞中的低密度脂蛋白(Low Densith Lipoprotein,LDL)相关，研究发现：调节ZNF580在EA.hy926内皮细胞中的表达，不仅可以调节MMP-2和VEGF的表达，还可以促进EA.hy926细胞的迁移和增殖[17]. pEGFP-ZNF580基因质粒是融合了绿色荧光蛋白编码的基因，所以细胞转染后利用倒置荧光显微镜可以观察绿色荧光蛋白的表达情况，可直观评价细胞转染的结果. 本文前期研究[9]发现，以山梨醇为骨架制备的sorbitol-PLGA-g-PEI多臂嵌段阳离子共聚物，携载融合质粒pEGFP-ZNF580(pDNA)自组装形成基因复合胶束，可将ZNF580基因携带进入EA.hy926细胞，明显增强了细胞的迁移能力[9]. 为了解决细胞黏附困难的问题，将特异性靶向内皮细胞的CAGW(Cys-Ala-Gly-Trp)多肽接枝在(PLGA-PEI)阳离子共聚物末端，携载pDNA质粒形成PLGA-PEI-CAGW/pDNA基因载体具有增强的细胞特异黏附功能，不仅降低了细胞毒性还提高了EA.hy926细胞的转染效率[11].

图7为细胞转染12 h和24 h时的明场和暗场照片，结果显示：细胞转染12 h时，PEI(1.8 kDa)/pDNA基因复合胶束不具有细胞转染能力(图7A中P1

图7 基因复合胶束转染EA.hy926内皮细胞12 h和24 h的明场和暗场图像

Figure 7 The fluorescence and corresponding bright-field images of EA.hy926 cells transfected by different gene complexes for 12 h and 24 h

注:P1明场/暗场为图PEI (1.8 kDa)/pDNA基因复合胶束转染细胞12 h、P1’明场/暗场为PEI (1.8 kDa)/pDNA基因复合胶束转染细胞24 h；A明场暗场图为PPD/pDNA基因复合胶束转染细胞12 h、A’明场暗场图为PPD/pDNA基因复合胶束转染细胞24 h；B明场暗场图为PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束转染细胞12 h、B’明场暗场图为PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束转染细胞24 h；P2明场暗场图为PEI (25 kDa)/pDNA基因复合胶束转染细胞12 h、P2’明场暗场图为PEI (25 kDa)/pDNA基因复合胶束转染细胞24 h.

暗场图)；PEI(25 kDa)/pDNA可有效地转染EA.hy926细胞(图7A中P2暗场图)；PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束也能有效转染细胞(图7B)；PPD/pDNA基因复合胶束的转染效果较弱(图7A). 细胞转染24 h时，PEI(1.8 kDa)/pDNA基因复合胶束虽具有细胞转染能力，但是效果依然较差(图7B中P1’暗场图)；PEI(25 kDa)/pDNA转染细胞能力下降，可能是因为PEI (25 kDa)/pDNA基因复合胶束细胞毒性大，导致细胞死亡数目增加(图7B中P2’暗场图)；PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束细胞转染效率有所提升(图7B中B’暗场图)，PPD/pDNA基因复合胶束的转染效果虽依然较弱，但是明显较12 h的转染效率增加了(图7B中A’暗场图). 这样的转染结果表明，由于REDV多肽的修饰，增加了细胞和载体的双向选择，使得载体的基因转运能力提升，转染效率明显提高.

2.6 基因复合胶束的细胞摄取率分析

基因复合胶束在细胞附近大量聚集会产生较高的细胞毒性，载体携带基因能够快速通过磷脂双分子层进入细胞是基因转运的前提，所以想办法提高细胞摄取率对转染效率有较大的影响[18-19]. PPD与PPD-CREDVW聚合物，分别携载Cy5标记的寡核苷酸自组装形成基因复合胶束. 通过流式细胞分析技术考察EA.hy926细胞的摄取能力(图8). 结果表明：PEI(1.8 kDa)/pDNA、PPD/pDNA、PPD-CREDVW/pDNA三组基因复合胶束组细胞摄取率均高于99%，这表明各种基因复合胶束均能够被EA.hy926细胞摄取. 然而平均荧光强度结果表明PPD/pDNA基因复合胶束组的平均荧光强度为1 108.05±324.68，PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束组的平均荧光强度为1 619.75±35.36，两组基因复合胶束组的细胞摄取率均高于对照组. 说明CREDVW多肽功能化修饰PPD聚合物制得PPD-CREDVW聚合物，PPD-CREDVW聚合物携载基因作为基因转运载体比未功能化修饰的载体更有利于提高细胞摄取，对增强细胞转染效率是有益的.

图8 流式细胞分析测定基因复合胶束的细胞摄取率

注:P1为PEI(1.8 kDa)/pDNA基因复合胶束转染细胞；P2为PEI(25 kDa)/pDNA基因复合胶束转染细胞；A为PPD /pDNA基因复合胶束转染细胞；B为PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束转染细胞.

3 结论

采用CREDVW多肽功能化修饰制备了PPD-CREDVW阳离子聚合物，在n(N)/n(P)=5时PPD-CREDVW聚合物胶束能够阻滞pDNA质粒迁移的形成稳定的PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束，随着n(N)/n(P)的增加，基因复合胶束粒径均在100～200 nm之间呈逐渐减小的趋势，电位逐渐增加. 细胞转染实验证明：PPD-CREDVW/pDNA基因复合胶束能够有效降低细胞毒性，并增强基因复合胶束与EA.hy926细胞的双向选择，提高了细胞转染效率. 总之，PPD-CREDVW复合胶束是一种高效、低毒的基因转运载体. 能够为解决内皮细胞生理环境复杂，在载体结构中引入环境适应性结构等研究提供有效的策略和指导.