苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其生物信息学分析

王 潇, 韩秀清, 成思琼, 郝兴安

(1.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100；2. 陕西新世界果业集团有限公司，陕西 杨凌 712100)

苹果茎沟病毒是一种寄主范围广泛的潜隐性病毒，一般不表现出明显的外部症状，但影响嫁接亲和性，以及苹果树的发育和产量[1]。苹果树被ASGV侵染后产量可减少30%，而且果面光滑度降低，造成果实产量和品质下降，甚至引起果树死亡。一旦被侵染，果树将终生代毒，会给果品生产带来持续性的危害。除了危害苹果树外，该病毒还侵染梨、柑橘、樱桃、杏等果树和百合[2-4]。

ASGV是我国苹果和梨树上发生普遍的潜隐病之一，分布于各主要苹果和梨产区。刘福昌等(1989)报道我国的渤海湾果区、黄河故道果区和西北高原果区栽苹果品种和营养系矮生砧木潜带ASGV的带毒株率为33.4%～100%[5]。

ASGV是发形病毒属(Capillovirus)的代表种。ASGV粒子为弯曲线状，长600-700 nm，直径12 nm，螺旋对称结构[6, 7]。

苹果茎沟病毒基因组为6 496 nt的正义单链RNA, 其3' 端有一个Poly(A),上游是一个142 nt的非翻译区。基因组RNA 含有2 个开放阅读框(ORF), 其中ORF1编码产生一个241 kD的多聚蛋白, 随后切割成一些功能产物, 包括甲基转移酶(Mt)、类木瓜蛋白酶(PPro)、解旋酶(Hel)和聚合酶( Pol),外壳蛋白(Coat Protein, CP)在C端；ORF2位于ORF1 之内,靠近3'端,编码一个36 kD的运动蛋白(Movement Protein, MP)[8, 9]。ASGV病毒MP基因与CP基因相对保守,且CP基因的保守性更强[9-11]。2000 年ICTV第7次病毒分类报告,将CP和MP基因氨基酸序列差异的大小作为发形病毒属(Capillovirus)分种的重要依据之一[7, 9]。GenBank数据库中8个ASGV分离物CP基因核苷酸序列同源性为89.5%～99.7%, 氨基酸序列同源性为93.2%～100%[7]。

苹果茎沟病毒病属于难治疗病害。至今尚无有效的防治药物，必须清除病株才能控制病害的蔓延。目前较为可行的控制措施是实行苗木脱毒及无毒栽培，控制其扩展。建立高效灵敏的检测技术，成为解决种苗检疫、抗病性早期鉴定等基本问题的前提，也是果树无毒化栽培的基本保障[1, 12]。

本研究以中国苹果上分离获得的ASGV毒原为材料，克隆了ASGV cp基因，分析比较了基因序列及其系统进化，预测并分析了蛋白结构和性质，并在原核系统中进行了表达分析。这为ASGV病毒抗体制备，以及基于血清学的ASGV检测方法的建立提供了重要的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

ASGV毒源采自陕西杨凌新世界组培公司苗圃基地。限制性内切酶、克隆载体pMD? 18-T Simple Vector购自TARAKA公司, M-MLV反转录酶，Taq酶, T4 DNA 连接酶及DNA 分子量标准购自FERMENTAS ( MBI )公司, Biozol-Reagent试剂购自Invitrogen公司,溴化乙锭，IPTG等购自Sigma公司。pET30a(+)表达载体，JM109，BL21(DE3) plyss感受态细胞等本实验室保存。引物合成和核酸序列测定由杨凌奥科公司进行。

1. 2 方法

1.2.1 RNA提取 从陕西杨凌新世界组培公司苗圃基地采集疑似果树枝条和叶片，使用Biozol-Reagent提取植物总RNA。

1.2.2 RT-PCR扩增及产物的克隆 根据已报道的CMV CP基因序列(GenBank登录号D14995.2)，设计并合成克隆引物ASGV-CP1/2 (ASGV-CP1：ATGAGTTTGGAAGACGTGC，ASGV-CP2： CTAACCCTCCAGTTCCAGA )。依据基因克隆测序结果设计并合成表达引物ASGV-CP3/4 (ASGV-CP3:CGCGGATCCAGTTTGGAAGACGTGC，ASGV-CP4: CCGGAATTCCTAACCCTCCAGTTCCA)。其中ASGV-CP3/4在5'端和3'端分别引入了BamH I和EcoR I酶切位点(见下划线)。以植物总RNA为模板，以Oligod(T)18 Primer为引物进行反转录，再以ASGV-CP1/2为引物对进行PCR扩增。PCR产物克隆后测序。

1.2.3 重组表达载体构建 以阳性克隆质粒为模板，以ASGV-CP3/4为引物对，PCR克隆引入酶切位点。PCR产物纯化后T-A连接到克隆载体。测序验证后，BamH I/EcoR I双酶切后连接到pET30a(+)表达载体，热激转化BL21(DE3)plyss感受态细胞。

1.2.4 原核表达分析 测序验证的阳性克隆菌液，过夜活化后按1︰100(v/v)加入到LB培养基中，当菌液OD260达到0.2-1.0时，加入IPTG诱导表达3 hr。煮沸法提取总蛋白，12% SDS-PAGE电泳检测。

1.2.5 ASGV cp基因的分子生物学分析 采用

Vector NTI(10.0)进行ASGV CP基因核苷酸序列分析。采用DNAMAN软件进行ASGV cp基因核苷酸多序列比对分析。采用MEGA4.0软件[13]进行ASGV cp基因进化树构建。采用GenBank，SWISS-MODEL和NPS@等数据库中的在线软件对推译的ASGV-CP基因编码的氨基酸序列进行蛋白质结构分析及预测。

2 结果

2.1 基因克隆与序列分析

以苹果叶片总RNA为模板，ASGV-CP1/2为引物做RT-PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检查得到一条分子量约为700bp的特异性条带。将扩增获得的PCR产物经纯化回收后T-A连接，重组克隆经双向测序，拼接获得ASGV CP基因全长序列。采用GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)在线软件BLAST比对分析后确定为ASGV CP基因序列。ASGV CP开放阅读框全长714个核苷酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。理论上表达翻译处一个由237个氨基酸残基组成的27 kD蛋白。该基因产物和预期的ASGV外壳蛋白相符合[14, 15]。将该序列登录到GenBank数据库，登录号为EU236258。

2.2 序列比对与基因克隆

将该基因序列在GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)应用在线软件BLAST比对分析后，获得已报道的ASGV 7个分离物核苷酸全序列，分别是：分离于日本苹果的P-209(D14995.2)[16]，分离于日本百合的L(D16681)[15]，分离于日本百合的Li- 23(AB004063)[17]，分离于中国台湾金钱橘的Kumquat 1(AY646511)，分离于中国台湾脐橙的LCd-NA-1(FJ355920)，分离于韩国的梨树的ASGV- K(AY596172)和分离于美国野柠檬的CTLV-ML(EU553489)。采用DNAMAN软件，将ASGV CP基因的核酸序列和推导的氨基酸序列与以上7个分离物的cp基因比较，结果如表1。

表1 ASGV cp基因序列比对

注：斜线上为氨基酸同源率，斜线下为核苷酸同源率。

笔者试验分离得到的ASGV cp基因与其他分离物cp基因核酸同源率为88.80%～91.90%，氨基酸同源率为93.70%～96.60%。其中本试验分离得到的ASGV CP基因和分离自日本百合的L(D16681)，Li- 23(AB004063)同源率最高，核苷酸同源率达到了91.90%。来自于不同地区，不同气温带和不同寄主的ASGV分离物CP基因表现出了很高的同源性，反应出ASGV cp基因在ASGV病毒的进化和分化中是一个相对保守的基因。

以ASGV cp基因为模板，进一步构建了ASGV的系统发育树(图1)，结果发现所有的8个分离物分化为3个分支。来自日本百合的两个分离物L(D16681)和Li- 23(AB004063)聚合成一个小分支后，与分离自韩国的梨树的ASGV- K(AY596172)共同组成了一个大的分支。本试验中的ASGV cp与来自日本苹果的的P-209(D14995.2)组成另一个大的分支。分离于中国台湾金钱橘的Kumquat 1(AY646511)和脐橙的LCd-NA-1(FJ355920)，聚合成一个小分支后，与分离于美国野柠檬的CTLV-ML (EU553489)组成一个大的分支。来自相同或相似寄主的分离物，无论地区和气温带的差别，都具有同一的分支结构，由此可见ASGV具有寄主的专化性和保守性。另外，尽管在同源性比较中，试验中的ASGV cp基因与来自日本百合的L (D16681)和Li- 23(AB004063)同源率最高，但是在系统发育树中却聚合在不同的分支中，可见同源率不能完全反应进化关系，同源率高不一定表现出保守性强。考虑到在系统发育树分析中，来自相同或相似寄主的分离物具有同一的进化分支，应该认为系统发育树分析比序列同源性分析更能反映ASGV病毒的进化和分化趋势。

采用邻近法构建进化树，自展值为1 000。AB004063和D16681:分离自日本百合的Li- 23和L，AY596172: 分离自韩国梨的ASGV-K，D14995:分离自日本苹果的P-209，EU553489: 分离自美国野柠檬的CTLV-ML，AY646511和FJ355920: 分离自中国台湾金钱橘的Kumquat 1和LCd-NA-1。

2.3 蛋白结构分析

应用ExPaSy (http://www.expasy.ch/)在线工具ProtParam分析表明：ASGV CP是由237个氨基酸残基组成的27.13kD蛋白，等电点PI为7.67，酸性氨基酸残基总数(Asp + Glu) 为34，碱性氨基酸残基总数(Arg + Lys)为35。不稳定系数是52.38，属于不稳定蛋白。分子式为C1219H1892N334O355S7，总平均亲水性为-0.604，说明该蛋白是一个疏水蛋白。

用ExPaSy (http://www.expasy.ch/) 在线工具ProtScale(Hphob. / Kyte & Doolittle)对ASGV CP蛋白的疏水性/亲水性进行预测，结果表明ASGV CP在氨基酸序列第60位的K有最大值：为1.733，疏水性最强；第100和101位T，E有最小值-2.933，亲水性最强。在第12、44位、97～105位和202位极易形成亲水区域，表明在该处可能形成抗原位点。总体来看, ASGV CP的大部分氨基酸都属于疏水性氨基酸，整个多肽链表现为疏水性，与ProtParam分析结果一致。

通过简单模块构架搜索工具(Simple Modular Architecture Research Tool，SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)分析ASGV-CP蛋白结构功能域，除了两个低复杂度区域(low compositional complexity regions，LCR)外，未发现其他特异结构功能域。

应用GenBank在线工具Conversed Domain Database(CDD)对ASGV CP蛋白氨基酸序列进行保守结构域分析，在第53-235位发现了纤毛病毒属(Trichovirus)和葡萄病毒属(Vitivirus)外壳蛋白保守结构域，证实了ASGV病毒代表的发形病毒属(Capillovirus)病毒与纤毛病毒属(Trichovirus)和葡萄病毒属(Vitivirus)病毒的同源关系，三者均为线形病毒科(Flexiviridae)成员[18]。

应用在线软件TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)对ASGV CP氨基酸序列进行蛋白质跨膜区预测，结果表明ASGV CP仅有一个跨膜螺旋的存在，在氨基酸第58-82位的25个氨基酸可能构成由内向外的跨膜区。推测ASGV CP不是一个跨膜蛋白质。

2.4 二级结构分析

应用SWISS-MODEL及NPS@ (Network Protein Sequence Analysis)网络服务器(http://npsa-pbil.ibcp.Fr)在线软件，选用HNN，MLRC，DSC，PHD和Predator等程序综合分析ASGV-CP蛋白二级结构，汇总为"一致预测结果"如图2。分析结果显示ASGV-CP蛋白其二级结构由35.02% α-螺旋(Alpha helix，Hh)、10.55% β-片层(Extended strand，Ee)、47.26%无规则卷曲(Random coil，Cc)构成。其中α-螺旋7个，β-片层5个，其余为无规则卷曲。

2.5 三级结构预测

利用自动比较蛋白建模服务器SWISS-MODEL ( http://swissmodel.expasy.org)对ASGV CP基因的氨基酸序列进行三级结构的预测。SWISS-MODEL网络服务器是利用同源建模的方法构建蛋白质的高级结构。由于同源蛋白序列未知，故采用自动模式(Automated Mode)

由服务器自动选择同源序列进行建模。然而输出结果显示服务器无法建立有效的结构预测。比对查询后发现，尽管在SWISS-MODEL关联的EMBL-EBI数据库中有ASGV-CP基因的同源序列纤毛病毒属(Trichovirus)和葡萄病毒属(Vitivirus)外壳蛋白序列(IPR008879 Coat_protein_tricho/vitivirus)，但是数据库中并没有这类蛋白质已建立的蛋白结构数据记录。由于SWISS-MODEL是同源建模，推测同源序列数据的缺失是未能成功构建ASGV-CP蛋白高级结构的原因。

2.6 蛋白表达

重组质粒pECASGV-CP转化大肠杆菌BL21(DE3)plyss感受态细胞，经IPTG诱导表达，菌体蛋白SDS-PAGE电泳结果显示：在分子量约为35kD处出现了表达量显著增加的蛋白条带，与预期值相符(图3)。虽然非诱导的pECASGV-CP和空载体pET30a(+)在这一位置也出现了蛋白条带，但是非常微弱，说明在该位置大肠杆菌有自身表达条带，且表达量非常小。pECASGV-CP蛋白的表达覆盖了该条带的表达，诱导表达蛋白量显著增加，表现为明显的蛋白条带。表明ASGV CP基因可以在大肠杆菌高效表达。

3 讨论

苹果茎沟病毒病属于难治疗病害。一方面，由于感病果树在田间不表现出明显的症状，使得该病害在田间的发生与流行不易被发现；另一方面，缺乏有效的药物预防和治疗该病害，使得感病果树体内的病毒无法得到有效控制。因此，针对该病害目前较为可行的控制措施是实行检疫，控制其扩展。然而，在我国现有耕作制度下，果农往往自发地繁殖，培育和嫁接苹果树，从而无意识地造成了苹果茎沟病毒病的扩展。尽管建立高效灵敏的检测技术，成为解决种苗检疫、抗病性早期鉴定等基本问题的前提，也是果树无毒化栽培的基本保障。然而高灵敏度的分子生物学检测法，是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在[19]，并不适合于果农生产的实际需要。血清学检测方法简单易行，上世纪80年代，ELISA已经在国外应用于苹果无毒苗木生产体系中病毒的检测, 大大提高了效率, 并节约了人力、物力[20-22]。然而，由于苹果茎沟病毒在寄主体内含量低，病毒粒体富于柔性，颗粒之间相互盘绕，给病毒提纯带来了一定困难,从而很难制备出高质量的血清，同时血清学检测又耗费大量的抗体材料，因此限制了应用推广[23]。以苹果茎沟病毒外壳蛋白基因为材料，通过原核表达体系，获得大量的病毒外壳蛋白基因的表达蛋白，可以为大量制备苹果茎沟病毒抗血清，从而为实现苹果茎沟病毒田间大规模，低成本检测奠定基础。

ASGV的研究已经从初期的鉴定，检测，进入到较为全面的阶段，包括病毒基因组的测定与分析，病毒与寄主的关系等[4, 23, 24]。然而目前关于该病毒ORF的表达机制及基因功能的研究还较少。分析该病毒的表达机制及基因产物的功能，探明病毒在寄主体内表达、增殖、移动及致病的分子机理，这将为该病害的研究和控制提供重要的理论基础。

本研究结合了分子生物学试验和生物信息学分析，克隆、表达了ASGV CP基因，分析了ASGV CP基因生物信息学数据，为进一步进行病毒基因的生物功能验证奠定了基础。