鸢尾素对兔骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

翟 羽，董科明，郭红延，刘 翠，徐红梅，申叶春，李金儒，梅 稳

干细胞是组织工程的种子细胞，在体外具有分化成包括成骨细胞和脂肪细胞在内等多种细胞的潜能。干细胞的分化方向是由它所处的微环境所决定的[1]。BMSCs是一种组织工程中常用的种子细胞，有多条信号通路调控BMSCs的分化[2,3]，其中Wnt/β-catenin信号通路的作用尤为重要。激活Wnt/β-catenin信号通路可促进BMSCs成骨分化并抑制其成脂分化[4]。BMSCs的成脂分化又受到多种转录因子的网络调节，其中比较重要的转录因子包括氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα)等[5]，而PPARγ和C/EBPα又均受到Wnt/β-catenin信号通路的调控[6]。鸢尾素是新近发现的一种由运动诱导产生的肌源性细胞因子，在棕色脂肪组织中高表达[7]。最近有研究报道，鸢尾素可促进BMSCs成骨分化[8-10]，且可抑制脂肪组织的分化、成熟[11]。但是，鸢尾素对BMSCs成脂分化的影响及其作用机制尚不清楚。因此，本研究拟以体外培养的兔BMSCs为研究对象，观察鸢尾素对BMSCs脂向分化的影响并探讨其信号机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器 3个月龄雌性新西兰大白兔1只，购自军事科学院军事医学研究院实验动物中心。重组人鸢尾素(美国Phoenix Pharmaceuticals公司)；α-MEM培养基、高糖DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国amresco公司)；消炎痛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、普通牛胰岛素、地塞米松、L-谷氨酰胺、二甲基亚砜(DMSO, 美国Sigma公司)；油红O、异丙醇(上海国药集团)；Trizol(美国Invitrogen公司)；Wnt10a抗体(货号：(#sc-376028; 美国Santa Cruz公司)；BCA测定试剂盒(南京建成)；PVDF膜(美国Millipore公司)。

Herocell C1型CO2恒温培养箱(中国润度生物)；BCM-1000A型生物净化工作台(苏州安泰)；5702R型低速离心机、Biophotometer核酸蛋白测定仪(德国eppendorf公司)；Multiskan型酶联仪(美国赛默飞·世尔公司)；DYY-7C型电泳仪、DYCZ-40型转膜仪(六一仪器厂)；LW300LFT型正置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2 细胞增殖能力检测 取第2代兔BMSCs接种于96孔板，并将细胞分成2组：对照组仅采用含10%胎牛血清的α-MEM培养液培养；鸢尾素组则在α-MEM培养液中加入100 ng/ml的重组鸢尾素，剂量参考既往报道[8,11]。接种后1～11 d，每天采用MTT法检测BMSCs的增殖活性，检测方法参照文献[12]。

1.3 qPCR检测成脂相关基因的转录表达 将第3代BMSCs以1.0×104/孔的密度接种于24孔板，待细胞长满瓶底面积70%时，换为自行配制的成脂诱导培养液(在高糖DMEM培养基中加入10%胎牛血清、1000 nmol/L地塞米松、10 mg/L 牛胰岛素、60 μmol/L消炎痛和0.5 mmol/L IBMX)培养，同时加入0 ng/ml(对照组)或者100 ng/ml的鸢尾素(鸢尾素组)。 两组细胞分别成脂诱导培养7、14 d后提取总RNA，再将RNA反转录为cDNA并进行扩增。然后，检测PPARγ和C/EBPα等成脂相关基因的转录表达。扩增条件为：95 ℃预变性3 min，96 ℃变30 s，58 ℃退火30 s，73 ℃延伸45 s，扩增30个循环，最后73 ℃ 延伸10 min。基因引物由上海申工生物合成，序列见表1。

表1 成脂相关基因引物序列

注：GAPDH为内参

1.4 油红O染色及定量分析 对照组和鸢尾素组BMSCs在成脂诱导14 d后，倒掉诱导液，PBS缓冲液漂洗干净，10%中性甲醛固定30 min，然后进行油红O染色并于显微镜下拍照。最后，用异丙醇振荡洗脱至油红O脂滴全部脱落，并于490 nm处测定吸光度值。

1.5 Western blot检测Wnt10a的表达 对照组和鸢尾素组BMSCs在成脂诱导7 d后，依据Western blot实验的常规步骤[13]裂解细胞并提取总蛋白，凝胶电泳分离蛋白、转膜、显影后，采用Image J软件分析胶片灰度。

2 结 果

2.1 鸢尾素对BMSCs增殖活性的影响 BMSCs的增殖曲线呈S形，细胞在前5 d增殖缓慢，第6～7天增殖最快，此后细胞生长处于平台期。而鸢尾素对BMSCs增殖无明显影响(图1)，表明鸢尾素无细胞毒性。

2.2 鸢尾素对BMSCs成脂相关基因表达水平的影响 qPCR检测结果显示：在BMSCs成脂分化的第7天，与对照组相比，鸢尾素明显抑制成脂相关基因PPARγ[(0.20±0.06)vs(1.00±0.10)]和C/EBPα[(0.40±0.06)vs(1.00±0.12)]的转录表达(P<0.05)；甚至在BMSCs成脂分化的第14天，鸢尾素仍能显著抑制PPARγ[(0.61±0.06)vs(1.00±0.15)]和C/EBPα[(0.70±0.09)vs(1.00±0.18)]的转录表达(P<0.05)。

图1 BMSCs增殖曲线

2.3 鸢尾素对BMSCs成脂分化的影响 对各组BMSCs成脂诱导14 d后行油红O染色，对照组细胞中可见大小混合型的脂滴布满整个视野，而鸢尾素组细胞中脂质沉积明显减少。进一步对细胞中的油红O进行半定量分析，结果也证实鸢尾素组油红O的OD值显著低于对照组，差异有统计学意义[(0.45±0.05)vs(0.95±0.10)；P<0.05]。

2.4 鸢尾素对Wnt10a蛋白表达的影响 Western blot结果显示：在BMSCs脂向分化的过程中，鸢尾素能显著提高Wnt10a蛋白的表达水平，与对照组相比差异有统计学意义[(5.01±0.78)vs(1.00±0.25)；P<0.05]。

3 讨 论

本研究以兔BMSCs为细胞模型，发现在BMSCs成脂分化的过程中，鸢尾素能显著提高Wnt10a信号蛋白的表达，进而下调成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的转录表达，并最终抑制BMSCs成脂分化。

运动是预防肥胖和代谢性疾病的有效策略，不仅仅是因为运动能直接增强骨骼肌的强度，而且运动能诱导骨骼肌产生肌源性细胞因子，例如鸢尾素、白细胞介素-15和成纤维细胞因子21等[14]。这些细胞因子通过内分泌或旁分泌等方式调节机体的代谢，对机体器官的代谢紊乱起到间接的保护作用。因此，肌源性细胞因子是联系骨骼肌和机体其它系统的重要纽带[15]。鸢尾素是运动诱导骨骼肌产生的一种非常重要得细胞因子，它依赖激活PGC1α起作用[16]。分泌型鸢尾素的主要功能是通过上调解偶联蛋白1(UCP1)的表达，促进白色脂肪棕色化[7]，进而通过增加能量代谢来缓解代谢性疾病[17]。例如，有研究表明，鸢尾素能通过减少脂肪酸合酶的生成抑制人脂肪细胞内脂质的沉积[18]。本研究发现，鸢尾素能抑制BMSCs成脂分化。这间接地佐证了干细胞分化平衡理论，即促进干细胞向成骨细胞分化就会抑制干细胞向脂肪细胞分化，因为鸢尾素能促进BMSCs向成骨细胞分化已被广泛证实[8-10]。与本研究相似，有实验表明，鸢尾素也能抑制成熟的脂肪细胞分化[19]。

经典的Wnt信号通路是调控成骨与成脂的重要信号通路[20]。有研究报道称，鸢尾素可以通过下调sclerotin(一种Wnt/β-catenin信号通路的特异性抑制剂)来促进骨生成与矿化[21]。本实验发现，在抑制BMSCs成脂分化的过程中，鸢尾素能促进Wnt10a的合成。当然，在经典Wnt信号通路还存在其它配体，如Wnt10b和Wnt6等，未检测鸢尾素对其它配体表达的影响是本实验的一个局限性。Wnt信号通路调控成脂关键转录因子PPARγ，C/EBPα和脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)的表达，PPARγ和C/EBPα主要调控成脂早期的细胞分化，而FABP4主要调控成脂末期的细胞分化。本实验发现，无论在成脂早期(7 d)还是终末期(14 d)，鸢尾素都能显著抑制PPARγ和C/EBPα的转录表达。新近有研究表明[11]，无论是内源性还是外源性的鸢尾素均能抑制脂肪组织的成熟、分化，并且鸢尾素的抑制作用与激活Wnt信号通路相关，这与本研究的结果一致。

鸢尾素是纤维连结蛋白Ⅲ型域包含蛋白5(type III domain-containing protein 5, FNDC5)的分泌形式，FNDC5体内超表达可以显著升高循环中鸢尾素的水平[22]，而直接在BMSCs中超表达FNDC5能否抑制其自身成脂分化值得进一步探讨。本研究未进行剂量-反应实验，因此并不清楚其它干预剂量的鸢尾素对BMSCs成脂分化的影响，后续研究应设计多个干预剂量。

综上所述，本研究发现鸢尾素能够在体外抑制兔BMSCs脂向分化，并且鸢尾素的这种作用与激活Wnt信号通路有关。鸢尾素有望被开发成抑制BMSCs脂向分化，进而促进BMSCs成骨分化的一种新型药物。