云南玉溪冰糖橙果斑病致病菌的鉴定及室内药剂筛选

桂瑶，胡军华*，张蓉，资莉玲，施云庭

(1.西南大学柑橘研究所，重庆 400712；2.中国农业科学院柑橘研究所，重庆 400712；3.农业部西南地区果树科学观测实验站，重庆 400712；4.云南玉溪柑橘研究所，云南 玉溪 653100)

茎点霉属(Phoma)真菌侵染多种作物，造成叶斑、果斑、果腐及茎枯等症状，严重影响作物的生长及产量[1]，多种茎点霉已被列为中国检疫性病害。目前发现茎点霉属真菌寄主植物主要有西番莲、草莓、杨梅、茄子、天麻、香龙血树、青麻、田旋花以及凤梨科、棕榈科和竹芋科等10余科植物。多喙茎点霉(Phoma multiostrata)侵染多花筋骨草引起黑胫病[1]，导致植物整株枯萎死亡；南方茎点霉(Phoma jolyana)引起香蕉鞘腐病[2]；草茎点霉(Phoma herbarum)侵染玄参[3]，导致叶斑病的发生；苜蓿茎点霉(Phoma asparage)侵染黄芩，引起黄芩发生茎枯病[4]。1991年，陈慈相等[5]首次报道Phomasp.引起柑橘病害。

云南省玉溪地区是极早熟柑橘产区。据统计，截至2017 年，玉溪地区柑橘种植面积达1.47 万hm2, 产量约30 万t[6], 冰糖橙种植面积占柑橘种植面积的1/3。2016 年夏季至2017 年秋季，玉溪柑橘研究所工作人员观察到冰糖橙果实出现一种新型病斑，发病果实在幼果期出现针状的红褐色斑点，这种斑点随果实长大逐渐扩展，转变成黑褐色。笔者调查10 个冰糖橙果园，发现冰糖橙果实患病率达30%以上，采用代森锰锌、福·福锌等防控柑橘炭疽病的药剂进行防治，效果不佳。为明确这种新型果斑病病原，找到有效防控药剂，笔者于2017 年10 月采集典型病果，对病原进行鉴定，并进行了室内防治药剂的筛选，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

2017年10月，在云南玉溪采集冰糖橙病果，另从西南大学柑橘研究所采摘健康冰糖橙叶片和果实。3%噻霉酮可湿性粉剂、11.5%吡唑嘧菌酯悬浮剂、22.5%咪鲜胺水乳剂、60%唑醚·代森联水分散粒剂、50%甲基硫菌灵悬浮剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂、16%二氰·吡唑酯水分散粒剂、60%霜脲·嘧菌酯可湿性粉剂、40%多菌灵可湿性粉剂、70%丙森锌可湿性粉剂、80%代森锰锌可湿性粉剂等11种药剂为市售。

1.2 方法

1.2.1 果斑病病原菌菌株的分离与纯化

采用组织分离法[7]分离果斑病致病菌，并进行纯化培养，纯化菌株于4 ℃保存，备用。

1.2.2 菌株致病性测定

参照文献[8]和[9]的方法，测定致病菌的致病性。将健康的冰糖橙叶片与果实用75%乙醇浸泡60 s后，无菌水冲洗3次，自然风干，用接种针针刺10针，接种分离株菌饼(25 ℃光照培养7 d的分离株菌饼、直径6 mm)，以接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的叶片和果实为对照。接种2 d后移去菌饼，每隔2 d观察叶片发病情况，记录病状并拍照。

1.2.3 病原菌形态学与分子生物学鉴定

将病原菌分别接种在PDA、燕麦琼脂培养基(OA)、水琼脂培养基(WA)、麦芽膏琼脂培养基(MEA)上，25 ℃培养7 d，观察菌株生长情况，记录菌落形态和颜色，测量菌落直径，计算菌丝生长速率。观察、记录菌株产孢结构和分生孢子以及菌丝的形态特征。参照AVESKAMP[10]方法，将病原菌接种到OA、MEA 培养基上，26 ℃下培养7 d，在菌落边缘滴加1 mol/L 的NaOH，处理后每隔10 min 观察培养基的颜色变化情况，直至培养基不变色为止。

分离菌株培养7 d 后，采用植物基因组DNA 提取试剂盒(天根公司)提取DNA，对核糖体DNA 内转录间隔区(ITS)基因、β-微管蛋白(tub2)基因、细胞延伸因子基因(EF1-α)、线粒体小亚基核糖体DNA(SSU)、肌动蛋白基因(ACT)序列进行扩增，引物(表1)由华大基因公司合成。50 μL PCR 反应体系：0.4 μmol/L 引物、3 ng 总DNA 模板和25 μL 2XT5Super PCR Mix，用双蒸水补充至50 μL。扩增程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s, 55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，最后72 ℃补充延伸2 min。4 ℃保存，PCR 扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，后送华大基因公司测序。将序列提交至NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行比对分析，运用MEGA7.0 软件邻近法进行聚类分析，构建系统进化树(1 000 次重复)。

表1 采用的引物及其序列 Table 1 Primers and sequences used in this study

1.2.4 杀菌剂室内毒力测定

采用生长速率法[16]测定11 种杀菌剂对分离菌株的毒力大小。运用PBT 数据处理系统对各药剂试验结果进行统计分析，获得各杀菌剂对菌株的毒力回归方程、抑制中浓度EC50、EC90(μg/mL)和相关系数。

2 结果与分析

2.1 冰糖橙果斑病症状及致病菌的致病性

2016年，调查发现冰糖橙果实上开始出现红棕色针状小斑点，背面为黄褐色病斑，边缘有黄褐色的晕圈(图1)，随着病害逐渐加重后会逐渐扩大为椭圆形、圆形或者不规则的黑褐色病斑，直径1～6 mm。2018年，病果率已超过30%。果实上的病斑较多，叶片和枝条上发生较少。2017至2019年，从病果样品中分离得到真菌，其中茎点霉属真菌分离比例达90%。

图1 冰糖橙新型果斑病果实症状 Fig.1 Symptom of Bingtang orange with a new type fruit spot

用分离的致病菌菌株NS2-2、NS2-6、guo-1针刺接种菌饼法处理健康冰糖橙叶片和果实，7 d和14 d后调查显示对照叶片和果实未发病，接种的发病率为100%，接种后初期病斑呈不规则水渍状浅褐色，逐渐扩展成圆形黑褐色大病斑，5 d后病斑直径达到10～20 mm，10 d后病斑面积占果实或叶片面积的近1/2(图2)。从发病叶片和果实上分离致病菌，所获分离株的形态特征和培养性状与菌株NS2-2、NS2-6、guo-1完全一致。

2.2 果斑病致病菌的形态学和分子生物学特征

图3显示，guo-1、NS2-2、NS2-6菌株在PDA培养基上迅速生长，气生菌丝发达，呈绒状；菌落呈圆形，边缘整齐，生长过程中会产生色素，生长初期菌落呈白色，后变为粉色，后期呈赤红色；在OA培养基上菌落初为乳白色，后变为褐色，菌丝埋生，分支，具隔膜，生长相对迟缓，气生菌丝发达，培养7 d后菌落具有不同程度的菌丝膨胀；在MEA培养基上菌落边缘整齐，并产生少量气生菌丝，菌落呈乳白色。

经近紫外线照射培养后，病原菌可在PDA 培养基上生成产孢结构，菌丝无色至浅黄色，分枝，分隔(图4)。在培养基菌落表面或培养基质中产生黑褐色分生孢子器，呈球形或近球形，直径为70～130 μm，多数散生，少数聚生，具乳突状孔口，产孢细胞为瓶梗状。分生孢子呈椭圆形或圆形，无色，单孢，平均大小为(2～2.5) μm×(4.1～5.4) μm，长宽比为2.1～3.2；老化的孢子含有1～2 个隔膜，稍带暗褐色。

图3 致病菌株在PDA、MEA、OA 上培养的形态特征 Fig. 3 Morphological characteristic of isolated strains guo-1, NS2-2, NS2-6 on OA, MEA, PDA culture media

图4 PDA 培养基上guo–1 菌株的菌丝、产孢结构和分生孢子 Fig. 4 Characteristic of mycelium, pycnidiums and conidium from strain guo-1 on PDA medium

将菌株guo-1接种到OA培养基上，25 ℃培养7 d，在菌落边缘滴加1 mol/L NaOH，10 min后，OA培养基变成绿色，2 h后OA培养基逐渐变红，可判断guo-1菌株在OA培养基上NaOH反应为阳性，符合茎点霉属真菌的NaOH颜色反应特征。根据菌株在PDA、OA、MEA培养基上的菌落、分生孢子器、分生孢子等形态学特征以及NaOH颜色反应， 参照《中国真菌志球壳孢目茎点霉属、叶点霉属》[17]和《PhomaIdentification Manual》[1]的描述，初步鉴定这3个菌株为无性孢子类、球壳孢目、茎点霉真菌(Phomasp.)。

对分离菌株的ITS、LSU、SSU、TUB、EF1-α和ACT基因进行测序分析，将扩增的序列分别提交至GenBank，利用Blast对分离菌株进行同源性比对，结果表明，3个分离株的ITS与Phomasp.菌株同源性最高，具有98.51%的同源性，这3个分离株的LSU与Phomasp.菌株同源性为 98.98%，SSU序列与Phomasp.菌株的同源性为97.89%，TUB序列与Phomasp.菌株的同源性为99.49%，EF1-α与Phomasp.菌株的同源性为97.74%，ACT序列与Phomasp.菌株的同源性为 97.39%。表明分离菌株与多个茎点霉属(Phomasp.)菌株一致性达到99%以上。多基因联合系统进化结果显示，分离菌株与茎点霉属菌株(Phomasp.)聚为一支，说明它们为茎点霉属真菌(图5)。

图5 致病菌菌株基于ITS、SSU、TUB、EF1–α、ACT 合并序列的系统发育树 Fig.5 Phylogenetic tree of strains guo-1,NS2-2 and NS2-6 constructed by neighbor joining method based on ITS, SSU, TUB, EF1 - α and ACT combined sequences

2.3 杀菌剂对致病菌株的毒力

杀菌剂对分离菌株的毒力结果(表2)表明，3%噻霉酮、11.5%吡唑嘧菌酯、22.5%咪鲜胺、60%唑醚·代森联、50%甲基硫菌灵的EC50均低于1.000 0 μg/mL，说明这5种药剂对菌株guo-1的毒力活性最强，抑菌效果较好；75%肟菌·戊唑醇、16%二氰·吡唑酯、60%霜脲·嘧菌酯、40%多菌灵、70%丙森锌的EC50值大于1.000 0，小于11.000 0，表明这些药剂对菌株guo-1具有一定的毒力作用，但效果一般；80%代森锰锌则对guo-1几乎无抑菌作用。

表2 杀菌剂对分离菌株的抑菌作用 Table 2 Antibacterial effect of different fungicides on the isolated strains

3 结论与讨论

采用组织分离法，从云南玉溪冰糖橙病斑上分离得到3株较强致病性真菌，通过形态学鉴定、分子鉴定和致病力测定，确定致病菌为茎点霉(Phomasp.)。菌株对3%噻霉酮可湿性粉剂和11.5%吡唑嘧菌酯悬浮剂、22.5%咪鲜胺水乳剂、60%唑醚·代森联水分散联剂非常敏感，可进一步进行大田试验。常规保护药剂80%代森锰锌可湿性粉剂、70%丙森锌可湿性粉剂、40%多菌灵可湿性粉剂等对致病菌的抑制效果差，建议田间减少使用。

Phomasp.可侵染多寄主，致病力较强，有扩展的风险，应加大监测力度，在室内药剂筛选的结果上尽快开展田间试验，为病害防控提供有效药剂。防控药剂也要加强针对性，防止病害扩展。目前，茎点霉属真菌在田间经常出现变种，鉴定难度非常大，此次在柑橘上鉴定到的茎点霉有可能是茎点霉属新种, 但还需要进行后续的鉴定。