外源性GDF11对SD大鼠动脉血管钙化的影响

张宸铭，刘 宇，盛 瑛，徐佰达，靳天慧，刘叶红，马 涛，王 倩，徐红波，宗刚军,

血管钙化 (vascular calcification, VC)是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变、血管损伤、慢性肾病和衰老等普遍存在的共同病理表现。主要表现为血管壁僵硬、顺应性降低，是心脑血管疾病高发病率和高死亡率的重要因素之一，也是动脉粥样硬化心血管事件、脑卒中和外周血管病发生的重要标志病变[1]。 由于VC机制复杂，目前还没有针对性的治疗手段。

近年来，有研究[1-2]发现，生长转化因子11(growth differentiation factor 11,GDF11)作为转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的新成员，具有逆转小鼠因高龄化导致的心、脑血管疾病，保护血管内皮的作用。VC虽发生机制复杂，但其发生机制之一为血管内皮损伤，由此猜测GDF11或可影响VC进程。该研究拟建立SD大鼠VC模型，探讨GDF11对VC的作用，旨在寻找新的VC干预靶点，为治疗VC提供新的可能。

1 材料与方法

1.1 动物30只6月龄雄性SD大鼠，400～500 g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。动物分笼饲养，自由摄食和饮水，室温控制在(24±2) ℃，湿度<60%，光照时间为8:00～20:00。实验前禁食12 h，不禁水。

1.2 仪器与试剂大鼠固定板、注射器、动物灌胃器、动物解剖器材、离心机、水浴锅、琼脂凝胶电泳系统、分光光度仪、病理包埋机及切片、大鼠源r-GDF11(武汉EIAAB公司)；骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein-4，BMP4)、GDF11 ELISA试剂盒(武汉EIAAB公司)；GDF11蛋白溶媒(武汉EIAAB公司；组分：NaH2PO4、NaCl、咪唑、10%甘油、pH 8.0)；BMP4(100 μg)、成骨特异性转录因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)(100 μg)、GDF11(100 μg)抗体(英国abcam公司)；β-actin抗体(50 μl，上海absin公司)；山羊抗小鼠HRP标记二抗、羊抗兔HRP标记二抗(1 ml，上海碧云天公司)；蛋白marker(上海Thermofisher分公司)；生理盐水、花生油、尼古丁(上海碧云天公司)；维生素D3(vitaminD3，VD3)(上海碧云天公司)；无水乙醇、组织标本包埋盒(武汉伊艾博公司)等。

1.3 方法

1.3.1实验动物的分组及模型制备 30只6月龄SD大鼠随机均分为5组。在适应性饲养1周后进行实验。钙化组予以生理盐水(1 ml/kg)，溶媒组溶媒液(1 ml/kg)，低浓度组(5% GDF11 1 ml/kg)、中浓度组(10% GDF11 1 ml/kg)、高浓度组(20% GDF11 1 ml/kg)进行腹腔注射，每日1次，持续7周[3]。实验第7周末，配置尼古丁·花生油悬浊液10 mg/ml(1g尼古丁搅拌融入100 ml花生油)，VD3·无水乙醇6×106U/ml，分别在实验第7周末最后一天8:00、18:00将配置好的尼古丁·花生油悬浊液搅拌均匀，并按25ml/kg对大鼠灌胃；取冷藏的VD3·无水乙醇溶液，按0.5 ml/kg对大鼠肌注一次[4]，继续饲养7周。实验第14周末，每组SD大鼠均予以10%水合氯醛·溶液2 ml/kg腹腔注射麻醉。心脏采血获取大鼠血液。取血之后，备皮、剖开胸腔腹腔，分离升主动脉至腹主动脉分叉处的主动脉血管。

1.3.2血液ELISA检测 每组提取的血液放入抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，取离心后上清液，按实验分组顺序分别加入BMP4、GDF11 ELISA试剂盒中。具体操作步骤按照试剂盒说明进行。

1.3.3钙化病理学检测 取每组3根主动脉，在生理盐水中去除附着的结缔组织、周围脂肪及管腔内的残余血液。用滤纸吸干后取主动脉弓部行横切，弓部至胸主动脉纵切，将切好的组织放入病理组织包埋盒，常规脱水、包蜡。使用石蜡切片机将动脉蜡块切成4 μm薄片，毛笔蘸至温水中轻展，载玻片捞出，烘烤载玻片至石蜡溶解，依次放入二甲苯、二甲苯、无水乙醇、无水乙醇脱蜡，烘箱烘干后，在紫外灯照射下Von kossa试剂染色10 min，之后HE染色复染，具体操作步骤按照试剂盒说明进行，光学显微镜下观察各组动脉钙化程度。

1.3.4Western blot检测 将每组剩下3根主动脉分别放入EP管中，在碎冰中使用眼科剪将组织剪成泥状，低温提取主动脉总蛋白，检测BMP4(一抗1 ∶1 000)，RUNX2(一抗1 ∶1 000)，GDF11(一抗1 ∶2 000)及内参蛋白β-actin(一抗1 ∶3 000)。于80 V恒压电泳40 min左右待marker分开后，调至120 V恒压电泳至上样缓冲液脱落，350 mA恒流转膜80 min，5% BSA封闭1 h，孵育一抗4 ℃过夜，TBST洗膜5 min’5次，二抗(1 ∶1 000)室温孵育1 h，洗膜5 min’5次，滴加ECL曝光液进行显影，采用Image J软件分析条带灰度，以目的蛋白与β-actin比值表示相应蛋白表达水平。

1.3.5免疫组化检测 1.3.3步骤中蜡块相同切片、脱蜡、水化、抗原修复、阻断、封闭、洗涤孵育过夜，复染、脱水、透明封片(抗体稀释度分别为：BMP4 1 ∶250，RUNX2 1 ∶150，GDF11 1 ∶50，羊抗兔HRP标记二抗1 ∶50，山羊抗小鼠HRP标记二抗1 ∶50)。光学显微镜200倍下观察目的蛋白BMP4、RUNX2、GDF11的免疫组化。

2 结果

2.1 Von kossa-HE染色观察5组主动脉VC程度通过Von Kossa切片可见，钙化组及溶媒组动脉中膜处有大量黑褐色钙盐沉积，中膜弹力纤维断裂，纵向钙化延伸及整根动脉标本；低、中、高浓度组中膜钙盐沉积，弹力纤维断裂情况较钙化组及溶媒组明显减轻，钙盐沉积量按低、中、高浓度依次减少，弹力纤维断裂程度依次减弱。见图1。

2.2 5组大鼠血清中BMP4、GDF11含量测定钙箭头处：钙化组及溶媒组钙盐大量沉积，弹性纤维断裂；低浓度组钙盐沉积，弹性纤维完整；中浓度组及高浓度组钙盐几乎无沉积，弹力纤维光滑完整。

图1 5组大鼠主动脉切片 Von kossa-HE染色 ×20

化组与溶媒组之间的血清BMP4、GDF11含量差异无统计学意义(P>0.05)；钙化组与低、中、高浓度组，溶媒组与低、中、高浓度组及低、中、高浓度组各组间血清BMP4、GDF11含量差异均有统计学意义(P<0.05)；随r-GDF11剂量增加，血清GDF11含量越低(见表1，因RUNX2为核蛋白，血清中无法测得，故不采用ELISA法测定)。

2.3 钙化标志蛋白的表达Western blot显示，随r-GDF11浓度增加，钙化标志蛋白表达降低，各组间差异有统计学意义(P<0.05，见图2)。免疫组化法检测5组大鼠主动脉BMP4、RUNX2的表达：BMP4、RUNX2在钙化组及溶媒组表达最明显，呈棕红色，在r-GDF11 3组则表达较少，低、中、高浓度依次表达减少，见图3。

2.4 GDF11的表达免疫组化法检测5组大鼠主动脉GDF11的表达：在钙化组及溶媒组，GDF11表达微弱，在r-GDF11 3组中表达较高，低、中、高浓度组表达依次升高，呈棕红色。Western blot显示，随r-GDF11剂量的增加，血管中GDF11含量升高。

3 讨论

VC是一种十分普遍的血管损伤现象，在包含了6 814个社区的白种人、美国黑人、西班牙人、中国人等动脉硬化研究中[2]，男性的发病率分别是70.4%、52.0%、56.6%、59.2%，女性的发病率分别是44.7%、37.0%、34.8%、41.9%，而在当时没有发生动脉钙化的人里，后3年随访内有18%的人相继发生钙化。尽管进行了大量的VC研究，目前仍没有针对VC的有效干预靶点。

表1 ELISA法测5组血清GDF11、BMP4含量比较

与钙化组比较：□P<0.05；与溶媒组比较：#P<0.05；与低浓度组比较：△P<0.05；与中浓度组比较：☆P<0.05

图3 不同浓度r-GDF11的钙化标志蛋白及GDF11的免疫组化 ×200

随着TGF-β超家族的不断深入研究，已有实验[3]证实GDF11具有减轻动脉内膜的损伤，维持粥样斑块稳定、抑制骨质形成的作用。动脉钙化与粥样硬化在致病因素、发病机制、形成过程中具有诸多相似之处。Mei et al[3]的研究发现，外源性注射r-GDF11或腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)上调GDF11的表达能够抑制血管内皮去分化，减少内皮细胞的凋亡及炎症反应，稳定粥样硬化的脂质池以及维持弹力纤维的形态；在Lu et al[5]的研究中显示，r-GDF11可以在骨髓间充质干细胞内通过活化Smad2/3来抑制骨的形成。本实验在对大鼠腹腔注射不同剂量的r-GDF11的基础上，通过肌注VD3和尼古丁灌胃诱导SD大鼠钙化显示，r-GDF11组较钙化组及溶媒组的动脉钙盐沉积减少，动脉中膜弹力纤维保持完整，钙化标志蛋白表达降低，r-GDF11组与钙化组及溶媒组之间差异具有统计学意义，说明r-GDF11在一定程度上减弱的VC的程度，但其机制并没有完全阐明。VC的形成是多因素参与的结果，包括细胞的凋亡与自噬、炎症细胞的活化与迁移、平滑肌细胞向成骨细胞转化等。有研究[6]发现通过抑制Caspase-3可以减轻细胞钙化；Mei et al[3]已发现GDF11可以通过活化TGF-β/Smad2/3，AMPK/eNOS信号通路，抑制JNK和NF-κB信号通路来抑制动脉粥样硬化的进展。可以推测GDF11的作用机制之一可能是通过活化Smad2/3信号通路来抑制Caspase-3。

在研究[7]调查中显示，中国人血清中GDF11的含量随年龄增长而增加，女性的血清GDF11含量要高于男性，且血清中GDF11的含量与骨质密度呈负相关[8]；在动物研究[9]中发现，多种哺乳动物血清中GDF11的含量随年龄的增大而升高；而Glass[10]的研究证实，血清GDF11的升高是评估人类疾病的风险因素。本实验通过ELISA检测血清GDF11显示，血清中GDF11的含量与钙化程度有关，钙化组及溶媒组的血清GDF11含量较r-GDF11组明显升高，各组间差异有统计学差异，可以说明钙化程度越严重，血清GDF11含量越高。然而本实验通过外源性注射r-GDF11减轻血管钙化，血清中GDF11含量却随r-GDF11剂量的增加而减少，推测注射的r-GDF11可能集中于血管损伤处活化相关通路，参与内皮及中膜的修复，导致血清中游离的GDF11含量下降。

GDF11目前在心血管领域中已有多个成果，但没有与血管钙化有所相关的动物或细胞实验。而本实验在动物上探究了外源性予以r-GDF11与动脉血管钙化之间的关系，完善了GDF11在心血管领域的作用，为临床的VC治疗提供了一个新的方向。而如想将GDF11作为干预或治疗VC的手段，需要更进一步分子机制研究。