高尿酸背景下P2X7R的Arg 307>Gln位点基因型的功能研究

李曼云，陶金辉，方 璇，马 艳，潘显阳，厉小梅，李向培

痛风是一种由高尿酸血症和尿酸单钠盐(monosodium urate，MSU)晶体沉积引起的炎症性疾病。目前有研究[1]表明，细胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的变化可激活嘌呤受体P2X配体门控离子通道7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7, P2X7R)信号通路，协同MSU晶体刺激产生核苷酸结合寡聚化结构域样受体3[oligomerization domain (NOD)-like receptor family, pyrin domain containing 3，NLRP3]炎症小体并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 (Caspase-1)，使白细胞介素(interleukin，IL)-1β分泌量增加，导致痛风的发作。因此，ATP的显著变化是导致急性痛风性关节炎发生的关键。另外，临床有部分高尿酸血症患者一生从未发作痛风，可能与P2X7R多态性相关。因此，P2X7R可能是急性痛风性关节炎发作的一个关键调节因子。人类P2RX7基因上存在许多单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点。既往有研究[2-3]报道，携带人P2RX7基因Arg 307>Gln突变体的细胞使P2X7R功能降低甚至缺失。现拟探讨在人急性白血病单核细胞株 (human leukemic monocyte,THP-1)源性巨噬细胞中，通过建立高尿酸盐的背景，并分别转染野生型、突变体型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1细胞系，比较3种P2X7R功能的差异。

1 材料与方法

1.1 实验材料人急性白血病单核细胞株THP-1购自中国科学院上海细胞生物学研究所；胎牛血清与RPMI-1640 培养基均购自美国Gibco 公司；绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-慢病毒载体(lentivirus，LVs)购自上海汉恒生物科技有限公司；微量RNA提取试剂盒、 cDNA 逆转录试剂盒及 SYBR®Green PCR试剂盒均购自德国QIAGEN公司；P2X7R、 IL-1β、NLRP3、 凋亡相关斑点样蛋白含半胱氨酸天冬氨酸-1蛋白酶结构域(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-1 recruitment domain，ASC)、Caspase-1及β-actin PCR引物均购自上海生工生物科技有限公司；IL-1β试剂盒购自美国R&D Systems公司。

1.2 THP-1细胞的培养将THP-1细胞培养于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，5% CO2、37 ℃温箱中培养，密切观察THP-1细胞，培养期间每3 d更换1次培养基。

1.3 慢病毒搭载GFP荧光转染THP-1细胞并筛选目的基因取1×105个THP-1细胞，接种于48孔板培养，加入完全培养基培养过夜。第2天细胞融合达40% ～50%，加入GFP-LVs，同时加入聚凝胺后摇匀，放入37 ℃温箱中培养。转染72 h后，荧光倒置显微镜DMI3000B(德国 Leica公司)下观察慢病毒转染情况。转染成功后再次传代，并在荧光倒置显微镜下观察荧光是否衰减。

1.4 实验细胞分组及功能实验将转染过的THP-1细胞先用丙二醇甲醚醋酸酯 (phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)刺激3 h后，在野生型、突变体型Arg 307>Gln和空病毒型中各设置3组：MSU(M组)、MSU+ATP(MA组)、对照组(C组)，M组、MA组中加入MSU孵育6 h后， MA组中加入ATP孵育 1 h，分别收取3组中转染后THP-1细胞上清液和细胞。

1.5 ELISA检测细胞上清液中IL-1β各标本细胞上清液冻存于-80 ℃，实验时各标本置于4 ℃缓慢解冻，1 000 r/min、4 ℃离心15 min，根据说明书检测上清液中IL-1β表达水平。

1.6 qRT-PCR检测mRNA表达水平TRIzol(美国Invitrogen公司)溶液提取细胞总RNA，-80 ℃冰箱保存，最后集中进行定量测定。使用ABI7500全自动实时定量PCR仪进行检测，以GAPDH 为内参。反应条件: 95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40个循环。融解曲线分析: 温度60～95 ℃ ，每个样本重复3次，以保证结果的准确性。采用 ΔCt 和 2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 在MSU背景下，突变体型Arg 307>Gln降低了ATP刺激P2X7R分泌IL-1β的能力MA组中野生型、突变体型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1细胞上清液和细胞中IL-1β表达水平差异均有统计学意义(F=4.606，P=0.035 2；F=9.063，P=0.001 14)；其中，与野生型相比，突变体型Arg 307>Gln上清液中IL-1β表达水平降低(P=0.016 4)(见图1A)，细胞中IL-1β mRNA表达水平也降低(P<0.001)(见图1B)。然而，野生型和突变体型Arg 307>Gln与空病毒型相比THP-1细胞上清液和细胞中IL-1β表达水平均基本无差异(上清液：P=0.120 8、P=0.597 2；细胞：P=0.119 9、P=0.226 1)。C组和M组的野生型、突变体型Arg 307>Gln和空病毒型上清液和细胞之间差异均无统计学意义(上清液C组：F=0.891 5，P=0.458 1；上清液M组：F=2.375，P=0.138 9；细胞C组：F=4.794，P=0.057 0；细胞M组：F=1.399，P=0.301 2)。见图1。

图1 3种THP-1细胞上清液及细胞中IL-1β表达水平比较

A：上清液中IL-1β浓度; B：细胞中IL-1β mRNA；与野生型比较：*P<0.05,***P<0.001

2.2 在MSU背景下，突变体型Arg 307>Gln抑制了ATP刺激P2X7R对NLRP3的调控MA组中，野生型、突变体型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1细胞中NLRP3 mRNA的表达差异均无统计学意义(F=7.958；P=0.020 5)；其中，与野生型比较，突变体型中NLRP3 mRNA表达水平降低(P=0.027 9)。然而，野生型和突变体型Arg 307>Gln与空病毒型相比NLRP3 mRNA表达水平差异均无统计学意义(P=0.085 9、P=0.491 5)。C组和M组中野生型、突变体型Arg 307>Gln和空病毒型之间NLRP3 mRNA的表达水平均亦无差异(分别是F=3.906，P=0.082 0；F=0.339 8，P=0.721 7)。见图2。

图2 3种THP-1细胞中NLRP3 mRNA表达水平比较

2.3 MSU背景下，野生型和突变体型Arg 307>Gln THP-1细胞中ASC表达均显著增高，突变体型Arg 307>Gln不影响ATP刺激P2X7R对ASC的调控MA组中，野生型、突变体型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1细胞中ASC mRNA的表达水平存在差异(F=14.22，P=0.005 3)，野生型和突变体型Arg 307>Gln组的ASC mRNA表达水平升高，但2组间ASC mRNA表达水平均无差异(P=0.169 4)。然而，野生型和突变体型Arg 307>Gln与空病毒型相比，ASC mRNA表达水平均存在差异(P=0.002 2、P=0.028 3)。C组和M组中野生型、突变体型Arg 307>Gln和空病毒型三者之间ASC mRNA的表达水平差异均无统计学意义(F=1.097，P=0.379 2；F=4.761，P=0.057 8)。

图3 3种THP-1细胞中ASC mRNA表达水平比较

2.4 在MSU背景下，突变体型Arg 307>Gln THP-1细胞不影响ATP刺激P2X7R对Caspase-1的调控C组、M组和MA组中，野生型、突变体型Arg 307>Gln和空病毒型THP-1细胞中Caspase-1 mRNA表达水平差异均无统计学意义(F=0.591 5，P=0.582 8；F=2.445，P=0.167 2；F=0.903 8，P=0.453 8)。

图4 3种THP-1细胞中Caspase-1 mRNA表达水平比较

3 讨论

痛风作为一种自身炎症性疾病， IL-1β在MSU诱导的炎症通路中起着不可或缺的作用[4]。IL-1β的产生有3个步骤：IL-1β前体(pro-IL-1β)蛋白的产生；切割pro-IL-1β产生活性IL-1β蛋白；将IL-1β释放到细胞外环境中。其中， pro-IL-1β的处理，涉及到Caspase-1的激活，也是炎症小体活化的基本特征。

急性痛风性关节炎与MSU晶体形成密切相关。已有文献[5]证明，在体内MSU可被膜结合受体(如Toll样受体，TLRs)和细胞内模式识别受体(如NOD样受体)识别。THP-1源性单核细胞在PMA的作用下分化为THP-1源性巨噬细胞并通过Toll 2样受体(Toll-like receptor 2，TLR2)和TLR4识别MSU晶体破坏溶酶体，释放到胞质中的溶酶体组织蛋白酶B可结合NLRP3并激活NLRP3炎症小体[6]。在NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)的作用中，NLRP3可以通过其富含亮氨酸的重复序列结构域(leucine rich repeat，LRR)识别并结合MSU晶体参与痛风发病。目前认为PMA通过激活NF-κB 通路诱导 pro-IL-1β、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1)的表达，在NLRP3炎症小体的作用下使pro-caspase-1活化成为Caspase-1，促使 pro-IL-1β分化成为成熟IL-1β[7]。

既往Fettelschoss et al[8]用NLRP3激活剂即脂多糖刺激单核细胞系，后用ATP刺激。而Jhang et al[6]用PMA先刺激THP-1细胞分化为巨噬细胞系，再用MSU晶体激活下游信号通路，使IL-1β的分泌量显著增加。研究[6]发现pro-IL-1β水平上调，但NLRP3炎症小体和pro-caspase-1的表达水平不受影响。本研究中，使用ATP分别干预经PMA诱导并转染过野生型、突变体型Arg 307> Gln和空病毒型的THP-1源性巨噬细胞，比较它们分泌IL-1β的能力以及ATP-P2X7R-IL-1β信号通路上3个因子的表达水平。在MSU晶体建立的高尿酸背景下，由ATP孵育的野生型THP-1细胞上清液IL-1β和细胞中IL-1β、NLRP3的mRNA表达水平均显著高于突变体型。提示突变体型Arg 307> Gln可能影响了P2X7R功能，使ATP诱导的ATP-P2X7R-IL-1β通路分泌IL-1β的能力明显降低，从而可能降低了炎症的发生及痛风的发作。

NLR家族包含2种炎症小体，分别为NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2, AIM2)。当识别特异性激动剂后，NLRP3和AIM2可分别形成炎症小体。而凋亡相关斑点样蛋白含半胱氨酸天冬氨酸-1蛋白酶结构域(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-1 recruitment domain ，ASC)是一种衔接NLRP3和AIM2的衔接蛋白，它们相互作用。一方面，ASC可募集pro-caspase-1到NLRP3炎症小体复合物中，另一方面NLRP3和AIM2可诱导几乎所有的ASC分子聚合，形成Caspase-1活化平台—ASC斑点[9]，从而诱导了Caspase-1的活化和成熟[10]。在本研究中，当MSU或ATP作为激动剂作用于野生型和突变体型THP-1细胞时， MA组野生型ASC mRNA表达水平高于突变体型，但差异无统计学意义，推测与ASC斑点形成后大部分被释放到细胞外，相邻巨噬细胞通过吞噬作用摄取ASC斑点导致部分ASC损失有关[10-11]。

近年来，Keller et al[12]提出Caspase-1可激活其他底物，调控大量细胞因子和应激信号的分泌。Caspase-1还可以切割IL-1β的前体分子，使pro-IL-1β成为有活性成熟的IL-1β蛋白并在巨噬细胞中分泌出来[4]。由于Caspase-1可催化失活的酶原，通常在催化过程中自身被蛋白酶水解。本研究中， 各组Caspase-1蛋白的mRNA表达水平基本无差异，推测与其自身被蛋白酶水解有关[13]。