桥本甲状腺炎对妊娠早期小鼠海马5-羟色胺及受体的影响

夏 琴，杨 昊，柳田田，程 锦，吴章碧，王 囡，朱德发

桥本甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis，HT)是一种自身免疫性疾病，又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎，多发于女性[1]。其特征为血清甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、抗甲状腺球蛋白抗体(thyroid globulin antibody，TGAb)滴度显著升高，伴部分甲状腺滤泡破坏、甲状腺淋巴细胞浸润。近年来临床[2-3]发现妊娠合并TPOAb、TGAb阳性患者情绪障碍的发病率增加。5-羟色胺(5- hydroxytryptamine，5- HT)是一种参与情绪调节的重要神经递质，其神经元位于脑干中缝核投射大脑半球的许多区域，包括前额叶皮质、海马、伏隔核、纹状体等[4]。5-HT有7种受体，可通过与受体作用发挥多种生理功能。 其中5-羟色胺2c受体(5 -hydroxytrptamine2c receptor，5-HT2CR)与情绪反应密切相关[5]。现通过建立妊娠早期HT小鼠模型，观察其海马5-HT和5-HT2CR含量及分布是否受到影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物5～6周龄NOD雌性小鼠70只，雄性小鼠16只，体质量20～23 g，取自北京华阜康生物科技有限公司，在安徽医科大学实验动物中心SPF级动物实验室标准条件(室温20～24 ℃，湿度55%)下喂养。

1.2 主要试剂及仪器猪甲状腺球蛋白(porcine thyroglobulin，pTg)、完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA)、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)均购自美国Sigma公司;游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)试剂盒、游离四碘甲状腺原氨酸(free tetraiodothyronine，FT4)试剂盒、TGAb、TPOAb试剂盒均购自德国Rocha公司;促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)ELISA试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司;HE染色试剂盒购自上海科汇生物技术有限公司；5- HT ELISA试剂盒(瑞士Enzo公司，ADI-900-175)；兔抗鼠5-HT2CR 抗体(北京博奥森公司，bs-2959 R);免疫组织化学染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；荧光显微镜(日本Olympus公司) ;形态学图像分析系统(Image-ProPLus 6.0，美国MEDIA CYBERNETICS公司)。

1.3 实验方法

1.3.1动物模型制备 适应性喂养1周后，将70只NOD雌性小鼠随机均分为2组：正常怀孕组(CON组)、HT怀孕组(HT组)。造模步骤：将25 μg pTg溶于100 μl生理盐水溶液中，CFA与pTg溶液1：1混合于研钵中，冰浴条件下研磨至完全乳化。在HT组小鼠尾部皮下注射0. 1 ml/只。CON组注射含有等量生理盐水的CFA乳化剂。14 d后将CFA替换成IFA，与pTg制备成乳化液，同样操作方法在HT组小鼠尾根部1 cm处皮下注射0.1 ml/只。在CON组注射等量不含pTg的IFA乳化剂。7周后将2组小鼠分别以2 ∶1比例随机与雄鼠合笼，检到阴栓记为0.5 d，4.5 d造模结束。每组各随机选取16只孕鼠进行实验。本实验经实验动物伦理审查。

1.3.2血清制备及甲状腺激素水平测定 对小鼠深度麻醉后处死，打开小鼠腹腔，用1 ml注射器行下腔静脉采血。4 ℃冰箱静置6～8 h，高速离心机15 000 r/ min离心15 min 2次，分离血清。ECLIA检测FT3、FT4、TGAb、TPOAb；ELISA检测血清TSH。

1.3.3标本制备 小鼠处死后，在冰上迅速解剖脑组织，左侧脑组织固定于多聚甲醛中24 h后，石蜡包埋，连续矢状位切片(5 μm厚)。右侧脑组织迅速分离出海马组织放置无酶管中，-80 ℃冰箱保存；分离甲状腺，固定在多聚甲醛中，石蜡包埋，每只小鼠选取5个不相邻的冠状位切面。

1.3.4甲状腺HE染色 甲状腺石蜡切片经二甲苯脱蜡后、各级乙醇水洗后，苏木精染料染色15 min，盐酸乙醇分化后水洗返蓝后，伊红染色10 s，再经脱水、封片。光学显微镜下拍摄图片。

1.3.5ELISA检测海马5-HT表达 在涂有GxR IgG抗体的孔中加入标准品和样品，随后加入与碱性磷酸酶结合的5-HT溶液，再加入兔血清素多克隆抗体溶液。在室温下同时孵育期间，抗体以竞争性的方式与样品或结合物中的5-HT结合，然后加入pNpp基体溶液。碱性磷酸酶催化5-HT偶联物致底物变成黄色，添加停止液。酶标仪405 nm处测定吸光度(optical density,OD)值。计算样本中5-HT的浓度。

1.3.6海马5-HT2CR总蛋白提取和Western blot

1.3.6.1 海马总蛋白提取 取海马组织置于1.5 ml EP管中，加入组织裂解液及蛋白酶抑制剂，电动匀浆器冰上匀浆。4 ℃、15 000 r/min离心15 min;重复操作1次;用BCA法对样品进行蛋白定量。按比例样品中加入5×蛋白电泳上样缓冲液，然后热浴锅100 ℃、10 min蛋白变性，-20 ℃冰箱分装保存。

1.3.6.2 Western blot 各样本上样量18 μg，加电泳缓冲液进行SDS-PAGE电泳;转膜3 h，丽春红染色;脱脂牛奶室温封闭2 h;GAPDH(1 ∶4 000) 室温孵育40 min，一抗5-HT2CR(1 ∶500) 室温孵育120 min;GAPDH二抗(1 ∶150 000)室温孵育40 min，5-HT2CR 二抗(1 ∶100 000)室温孵育120 min。丽春红染色后三蒸水水洗3次，每次10 min，牛奶封闭后水洗3次7 min,一抗二抗用PBST清洗3次+PBS清洗，各10 min。滴加超敏显影液置化学发光成像仪显影，运用IPP 6.0分析蛋白条带灰度值。

1.3.7免疫组织化学法 将海马石蜡切片放置60 ℃烤箱30 min，二甲苯脱蜡3 次10 min，乙醇梯度降低水化;PBS+Triton X-100+30%过氧化氢细胞通透;枸橼酸钠盐加热修复抗原暴露抗原决定簇;山羊血清封闭30 min;以上各步骤间使用PBS洗涤3次，每次3 min。5-HT2CR抗体(1 ∶200) 室温孵育1 h后孵育过夜(4 ℃);HRP标记山羊抗兔IgG孵育40 min(37 ℃);以上各步骤间使用PBS洗涤5次，每次5 min；DAB显色，苏木精染色18 s，流水冲洗，PBS 8 min，脱水、封片。应用光学显微镜观察5-HT2CR分布及表达情况。

2 结果

2.1 各组小鼠血清甲状腺激素及抗体水平HT组血清TGAb、 TPOAb水平高于CON组(P<0.05)，FT3、 FT4、 TSH水平差异无统计学意义。见表1。

表1 各组血清甲状腺激素及抗体水平

与CON组比较:***P<0.001

2.2 甲状腺HE染色CON组小鼠甲状腺组织分布均匀，淋巴细胞浸润少见。HT组小鼠甲状腺滤泡排列紊乱伴部分破坏及淋巴细胞浸润。见图1。

图1 各组小鼠甲状腺 HE×400

2.3 海马5-HT表达水平与CON组相比，HT组小鼠海马5-HT表达水平降低(P<0.01)。见图2。

2.4 海马5-HT2CR的表达与CON组相比，HT组小鼠海马5-HT2CR的含量上调(P<0.001)。见图3。

2.5 5-HT2CR在小鼠海马各区表达及分布情况光镜下观察5-HT2CR免疫反应产物呈棕黄色颗粒。主要存在于海马CA1、CA3区锥体细胞层和DG区颗粒细胞中。CA1区阳性颗粒主要分布椎体层，腔隙层、放射层颗粒相对较少。CA3区锥体细胞呈圆形或椭圆形，突起长。免疫阳性反应物在椎体层最密集、深染，呈小片或树枝交叉状分布，放射层和腔隙层分布较少，呈中空树样分布。DG区颗粒细胞排列紧密，5-HT2CR免疫阳性反应物主要分布在分子层外三分之二。光镜下可见，HT组棕黄色面积大于且颜色深于CON组。见图4。

图2 各组小鼠5-HT表达

图3 各组小鼠海马5-HT2CR的表达

统计学分析小鼠海马各区5-HT2CR免疫反应产物，结果显示与CON组相比，HT组CA3区表达增加(P<0.01)。CA1区、DG区AOD值也有一定程度升高，但差异无统计学意义。见表2。

3 讨论

本研究选用 NOD雌性小鼠，利用pTg结合弗氏完全佐剂尾部底部皮下注射、弗氏不完全佐剂二次免疫[6-7]，然后与雄鼠合笼，妊娠4.5 d造模完成。结果显示，HT组小鼠血清 TGAb 和 TPOAb较CON组升高，甲状腺病理切片呈甲状腺滤泡部分破坏及淋巴细胞浸润等形态学改变。FT3、FT4、TSH 与CON组相比差异无统计学意义，提示造模成功。

图4 5-HT2CR免疫反应产物在小鼠海马各区的表达 ×400

表2 各组小鼠海马各区5-HT2CR表达水平

与 CON 组比较:**P<0.01

实验通过ELISA检测显示在妊娠早期,HT组小鼠海马组织中5-HT浓度低于CON组。课题组前期研究[8]发现桥本甲状腺炎小鼠额叶内吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine pyrrole-2, 3-dioxygenase, IDO)和5-HT转运体上调。 IDO1是5-HT前体色氨酸的关键代谢酶，当IDO1激活时，可以耗竭局部组织的色氨酸，可能导致5-HT原料不足，进而减少5-HT合成。而5-HT转运体表达上调则加速了该神经递质的再摄取，推测桥本鼠额叶内5-HT减少与IDO1和5-HT转运体表达的变化有关。Metaxas et al[9]研究发现阿尔茨海默症可增加小胶质细胞活化，炎性因子释放增加，诱导5-HT转运体失调机制，干扰5 -羟色胺能神经传递，降低5-HT水平。Wixey et al[10]发现早产儿缺血缺氧后会导致神经炎症，释放细胞毒性物质，影响5-HT转运体的表达，损伤5-HT能系统。结合以上研究推测在妊娠早期，HT小鼠海马内5-HT浓度降低可能与IDO1和5-HT转运体表达异常有关，具体机制有待进一步研究。

5-HT主要通过激活受体发挥作用。其中5-HT2CR是G蛋白偶联受体，为突触后受体，通过磷脂酶C激活第二信使传递信号引起下游细胞级联反应[11]，主要分布在啮齿动物海马CA3区的锥体层，其次为CA1区[12]，与情绪反应密切相关。本实验通过Western blot法测得HT组海马组织5-HT2CR相对灰度值高于CON组。免疫组化法显示5-HT2CR免疫阳性颗粒主要表达于海马锥体细胞和颗粒细胞中。与CON相比，阳性颗粒在HT组小鼠CA3区椎体层表达最多，CA1区和DG区也有增高趋势。说明在妊娠早期，HT小鼠海马CA3区5-HT2CR的表达增加。Di et al[13]研究报道5-HT的缺失增加了5-HT2CR mRNA的表达，通过这种微调节机制以适应突触活动的变化。Han et al[14]研究表明在帕金森患者中缝核5-HT2CR激活，对5-HT的负性调控作用增强, 引起5-HT含量降低，从而诱导焦虑行为发生。本实验研究与之一致。