高龄孕妇无创DNA产前检测和血清学唐氏筛查的应用研究

魏新亭，雍敏婕，哈迎春

我国为出生人口缺陷高的国家，缺陷疾病种类繁多[1]，其中以染色体疾病为主。有文献报道，临床发现染色体异常的胎儿中，高龄孕妇占40%以上[2]，而且年龄越大，唐氏综合征(DS)的发病率越高[3]。因此针对高龄孕妇选取经济高效且安全的产前筛查方法，提高异常胎儿检出率，是高龄孕妇们的迫切需求。血清学筛查是目前孕妇产前筛查的主要手段，且应用广泛，但该方法检出率低和假阳性率高，限制了血清学产前筛查的进一步发展[4]。近年来，无创DNA(NIPT)检测技术由于不需要进行创伤性取样，具有高敏感性和特异性，已越来越受到临床重视[5]。本研究对孕中期血清学唐氏筛查高风险的高龄孕妇进行无创DNA产前检测，分析检测结果，探讨无创DNA(NIPT)在产前诊断中的应用价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料：选择2017年1月-2018年12月在宁夏银川市妇幼保健院进行遗传咨询并签署知情同意书的1 986例单胎高龄孕妇行血清学产前筛查，筛查出高风险684例进行 NIPT检测，年龄35～42岁，平均年龄(38±2.4)岁，筛查孕周12～24周，平均孕周(17.4±4.5)周。

1.2 方法

1.2.1 血清学筛查：自愿接受筛查者抽取空腹静脉血2 mL，1 h 内分离血清并保存于-20 ℃冰箱，于1周内由专人检测。筛查仪器采用AutoDELFIA1235型全自动时间分辨荧光免疫分析仪，运用风险评估软件分析血清标记物甲胎蛋白(AFP)、游离人绒毛膜促性腺激素(F-HCG)及游离雌三醇(uE3)三联标记物的中位数倍数(MoM)值，结合孕妇年龄、体重、孕周等因素，计算每个胎儿患唐氏综合征的风险。操作程序严格进行质控，异常结果重复实验2次。唐氏综合征风险阳性切割值为1∶270，>1∶270为唐氏高风险。

1.2.2 无创DNA检测：用EDTA抗凝管抽取孕妇外周血5 mL，充分混匀，4 ℃保存，6 h 内分离血浆。采用血浆游离DNA 提取试剂盒提取胎儿游离DNA，操作过程严格按照试剂盒说明书进行，用文库构建试剂盒构建DNA文库，定量PCR对文库进行精确定量，经扩增反应后用NextSeq CN500测序平台进行测序检测，对每条染色体上核酸片段的序列进行生物信息分析。判断标准基于二元假设的Z-score值进行统计分析，确定21-三体、18-三体、13-三体的风险。当Z值≥3，判定胎儿DS高风险[6]。

1.2.3 胎儿染色体核型分析：接受产前诊断孕妇经遗传咨询后，在16～24周进行羊水穿刺获得羊水标本，经过细胞培养染色体核型分析明确诊断。

1.2.4 随访：对所有进行产前筛查及NIPT检测的孕妇进行产后电话随访，了解是否有假阴性结果。

1.3 统计学方法：采用SPSS 19.0统计软件，以羊水穿刺胎儿染色体核型结果为确诊金标准，计数资料用率表示，样本率差异分析用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清学筛查联合无创DNA检测结果：进行血清学产前筛查的单胎高龄孕妇1 986例，筛查出高风险684例，血清学筛查阳性率为34.44%。684例高风险孕妇进行NIPT产前检测，检出高风险35例(其中21-三体20例、18-三体5例、13-三体3例、性染色体数目异常7例)，NIPT检测阳性率为5.12%。

2.2 胎儿染色体核型分析：35例NIPT高风险孕妇均进行羊水穿刺产前诊断，确诊染色体数目异常27例，假阳性8例。胎儿染色体数目异常经遗传咨询均选择终止妊娠。8例假阳性孕妇随访妊娠结局均未见异常，见表1。

表1 无创DNA检测结果及胎儿染色体核型分析

2.3 两种筛查方法阳性结果比较：血清学筛查阳性率34.44%(684/1 986)，无创DNA检测阳性率5.12%(35/684)；血清学筛查假阳性率 33.08%(657/1 986)，无创DNA检测假阳性率1.17%(8/684)；血清学筛查敏感性66.92%(1 329/1 986)，无创DNA检测敏感性98.83%(676/684)；血清学筛查特异性66.56%(1 302/1 959),无创DNA检测特异性 98.78%(649/657)；血清学筛查阳性预测值3.95%(27/684)，无创DNA检测阳性预测值77.14%(27/35)。两种产前筛查随访未发现假阴性病例。两种产前筛查方法比较，阳性率、假阳性率、敏感性、特异性及阳性预测值差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两种筛查方法阳性结果(%)

2.4 两种筛查方法联合阳性筛出情况：进行血清学产前筛查的单胎高龄孕妇1 986例，筛查出高风险684例孕妇均进行NIPT产前检测，对检出高风险35例进行有创产前诊断，27例染色体数目异常，产前诊断率1.76%(35/1 986)。

3 讨论

DS在染色体疾病中最为常见，会在极大程度上影响患儿的正常生长发育及智力水平，给患者、家庭和社会带来巨大的精神及经济负担[7]。有资料显示传统孕中期血清学唐氏筛查的准确率为66%～80%，漏检率为20%～34%，假阳性率较高，其中高龄孕妇假阳性率接近20%[8]。由于产前诊断技术是有创的检查手段，会造成宫内感染、流产等风险，这也降低了患者对有创性产前诊断的依从性[9]。因此，为降低出生缺陷，积极寻找一种安全、高效、孕妇易于接受的产前筛查和诊断方法尤为重要。

据报道NIPT应用于DS胎儿检测的敏感性为98.6%～100%，特异性为97.9%～100%[10]。本研究显示NIPT检测DS的敏感性为98.83%，特异性为98.78%，与已报道的结果一致，进一步验证NIPT技术在高龄孕妇DS检测中是一种准确性和特异性均高的产前筛查方法。叶强等建议35岁以下孕妇血清学筛查高风险或临界风险，应该进行NIPT检测，35岁以上可以直接进行无创检测[11]。本研究对1 986例高龄孕妇进行血清学筛查，对筛查高风险孕妇684例进行NIPT检测，检出高风险35例，NIPT及血清学筛查阳性率分别为5.12%、34.44%。35例高风险孕妇均进行有创产前诊断，羊水穿刺率1.76%(35/1 986)；诊断染色体非整倍体27例，NIPT及血清学筛查假阳性率分别为1.17%、33.08%，敏感性分别为98.83%、66.92%，特异性分别为 98.78 %、66.56%。结果显示NIPT检测结果与有创产前诊断结果符合率较高，NIPT检测敏感性、特异性及假阳性率明显优于传统的血清学筛查方法。以往对所有高龄孕妇均进行有创产前诊断，既增加产前诊断感染及流产等风险，同时增加孕妇心理负担及经济负担。血清学筛查及NIPT两种筛查方法联合检测，对筛查高风险孕妇进行产前诊断可显著降低有创产前诊断率，显著提高染色体非整倍体疾病筛查的准确性，同时大大降低因年龄因素而进行的有创产前诊断风险，为高龄孕妇产前筛查提供了一种新途径。但该项检测有一定的假阳性率，对筛查高风险孕妇必须进行有创的产前诊断。本研究因NIPT检测样本量较小，尚未发现假阴性结果。

总之，高龄孕妇选择血清学筛查联合无创DNA检测可有效识别唐氏综合征的发生风险，明显提升唐氏综合征预测的准确性，同时明显降低有创产前诊断率，减轻有创诊断带给孕妇的心理负担及感染、流产风险，可作为高龄孕妇的主要筛查手段，具有较好的临床应用优势。