HOXA-AS2靶向miR-17对人脐静脉内皮细胞生物学功能以及炎症因子的影响

王磊 艾文 方叶青 陈之杰 邱小燕 李华英 谢培益

心脑血管疾病已成为当今社会最主要的致死和致残疾病，严重危害人类健康和生活质量，动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是血管系统疾病的主要病理基础，其发生机制复杂，内皮细胞损伤和炎症因子均与其发生发展有关[1]，研究AS 发生发展的分子机制，制定有效的预防和治疗措施，对提高AS整体防治水平具有重要意义[2]。研究发现长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）与血管炎症、内皮细胞和血管平滑肌细胞密切相关，在AS发生发展中发挥重要作用[3]。HOXA 反义RNA 2（HOXA cluster antisense RNA 2，HOXA-AS2）是一种lncRNA，研究显示HOXA-AS2可抑制恶性神经胶质瘤行为和血管拟态形成[4]，HOXA-AS2 敲低可抑制非小细胞肺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡并抑制迁移和侵袭[5]，HOXA-AS2通过抑制NF-κB信号传导的激活抑制内皮炎症[6]，然而HOXA-AS2对AS模型细胞生物学功能、炎症因子的影响及其机制尚不清楚。miRNA 也参与调控AS形成、发展的病理生理过程，在AS 中也起重要作用[7]，研究显示miR-17 在AS患者的血液中高表达，通过靶向自噬相关基因7（autophagy related gene 7，ATG7）促进巨噬细胞凋亡和炎症因子的表达[8]，miR-17 高表达于冠心病患者血清，与患者冠状动脉病变程度、侧支循环形成及血清氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）水平密切相关[9]，抑制miR-17-5p通过上调ATP 结合盒转运蛋白A1（ATPbinding cassette transporterA1，ABCA1）减少巨噬细胞RAW264.7 中炎症因子的产生和脂质积聚[10]，但miR-17对AS模型细胞生物学功能以及炎症因子的影响尚未清楚。本实验旨在研究HOXA-AS2靶向miR-17对AS模型细胞生物学功能、炎症因子的影响及其机制。

材料与方法

一、材料

人脐静脉内皮细胞株EA.hy926（上海莼试生物技术有限公司）；胎牛血清、DMEM培养基（美国Sigma公司）；氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）（广州奕源生物科技有限公司）；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（美国Progema公司）；蛋白提取试剂盒、二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、RIPA蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒、四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙锭（PI）试剂盒（碧云天生物技术研究所）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（北京Solarbio公司）；抗体（武汉维诺赛生物技术有限公司）；酶联免疫吸附试剂盒（ELISA）（上海继锦化学科技有限公司）；LipofectamineTM2000转染试剂（美国Invitrogen公司）；CO2孵育箱、Thermo FC酶标仪（美国Thermo公司）；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（美国Bio-Rad公司）。

二、方法

1.细胞培养：EA.hy926细胞用含10﹪胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5﹪ CO2条件下培养，2 d换液1次，取对数生长期细胞进行实验。

2.细胞处理与分组：按照参考文献[11]的处理方法对细胞进行处理分组；一共分为4个实验；实验1：用100μg/mL的ox-LDL处理EA.hy926细胞作为ox-LDL组，正常培养的细胞作为对照组；实验2：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2转染至EA.hy926细胞中再用100μg/mL的ox-LDL处理，记为ox-LDL+pcDNA3.1组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组；实验3：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2、si-NC、si-HOXA-AS2分别转染组、pcDNA3.1-HOXA-AS2组、si-NC组、si-HOXA-AS2组；实验4：将pcDNA3.1-HOXA-AS2 与miR-NC、miR-17分别共转染至EA.hy926细胞中再用100μg/mL的ox-LDL处理，记为ox-LDL+pcDNA3.1-HOXAAS2+miR-NC组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXAAS2+miR-17组。

3.实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测HOXA-AS2和miR-17的表达水平：各组细胞培养48 h，提取总RNA，将RNA 反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，每个样品设3个重复，实验重复3次。循环条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。HOXA-AS2和miR-17分别以GAPDH和U6为内参。（表1）

表1 引物序列信息

4.蛋白质印迹（Western blot）法检测P21、cleaved caspase 3、caspase3蛋白表达：提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量。各组蛋白上样量60 μg，SDS-PAGE后，经电转将蛋白转移至PVDF上。用5﹪脱脂牛奶室温封闭90 min，分别加入相应的一抗，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min；再加入二抗室温孵育2 h，PBS洗涤3次，每次10 min，后在暗室中曝光显影，再浸入定影液，最后洗去残液，晾干，将胶片用Quantity One 凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的灰度值，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。

5.MTT检测细胞增殖情况：在各组细胞培养48 h时，每孔分别加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培养箱中继续孵育4 h后弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡反应10 min，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度（OD）值。细胞增殖率（﹪）=实验组OD值/空白对照组OD值×100﹪。实验重复3次，每次设3个复孔。

6.流式细胞术检测细胞凋亡：各组细胞培养48 h后用预冷的PBS 漂洗2次，与500 μL的结合缓冲液混匀。先加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3个复孔，实验重复3次。

7.酶联免疫吸附法（ELISA）法检测IL-1、IL-6水平：各组细胞培养48 h后取上清，具体按照试剂盒操作进行检测。每组设3个复孔，实验重复3次。

8.荧光素酶报告实验检测HOXA-AS2对miR-17的靶向调控：构建野生型和突变型基因靶点HOXA-AS2的荧光素酶表达载体WT-HOXA-AS2和MUT-HOXA-AS2，用LipofectamineTM2000 将WT-HOXA-AS2和MUT-HOXA-AS2分别与miRNC、miR-17、anti-miR-NC、anti-miR-17共转染至EA.hy926细胞中。按照说明书检测荧光素酶活性，实验重复3次，每次设3个复孔。

三、统计学分析方法

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，HOXA-AS2、miR-17、P21、cleaved caspase 3、caspase3 相对表达水平，细胞增殖率，细胞凋亡率，IL-1和IL-6水平用表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、HOXA-AS2在ox-LDL作用的EA.hy926细胞中的表达

与对照组比较，ox-LDL组EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平及细胞增殖率降低，P21、cleaved caspase3、caspase3表达水平和细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1，表2）。

图1 对照组与ox-LDL组细胞相关指标的差异

二、过表达HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞增殖、凋亡的影响

与ox-LDL+pcDNA3.1组比较，ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组EA.hy926细胞中HOXAAS2表达水平和细胞增殖率升高，P21、cleaved caspase 3、caspase3表达水平和细胞凋亡率降低（P＜0.05，图2，表3）。

三、过表达HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞中IL-1和IL-6表达的影响

与对照组比较，ox-LDL组EA.hy92细胞6中IL-1、IL-6水平升高（t= 11.752、11.675，P均＜0.001）；与ox-LDL+pcDNA3.1组比较，ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组EA.hy926细胞中IL-1、IL-6水平降低（t= 8.085、8.911，P＜0.001）（表4）。

表2 HOXA-AS2的表达及ox-LDL处理对EA.hy926细胞增殖率、凋亡率及P21、cleaved caspase 3蛋白表达的影响（±s，n = 3）

表2 HOXA-AS2的表达及ox-LDL处理对EA.hy926细胞增殖率、凋亡率及P21、cleaved caspase 3蛋白表达的影响（±s，n = 3）

注：n为实验重复次数

分组 HOXA-AS2 P21 cleaved caspase 3 caspase 3增殖率（﹪）凋亡率（﹪）对照组 1.02±0.10 0.20±0.02 0.14±0.01 0.26±0.03 100.06±10.20 8.23±0.80 ox-LDL组 0.23±0.02 0.82±0.08 0.67±0.06 0.89±0.08 47.83± 5.01 26.81±2.47 t 值 13.417 13.023 15.092 12.771 7.961 12.395 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001＜0.001

图2 过表达HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞增殖、凋亡的影响

表3 过表达HOXA-AS2对ox-LDL处理的EA.hy926细胞增殖率、凋亡率及P21、cleaved caspase 3、caspase3蛋白表达的影响（±s，n = 3）

表3 过表达HOXA-AS2对ox-LDL处理的EA.hy926细胞增殖率、凋亡率及P21、cleaved caspase 3、caspase3蛋白表达的影响（±s，n = 3）

注：n为实验重复次数

分组 HOXA-AS2 P21 cleaved caspase 3 caspase 3增殖率（﹪）凋亡率（﹪）ox-LDL+pcDNA3.1组 0.22±0.02 0.81±0.08 0.69±0.06 0.88±0.08 48.21±4.86 26.83±2.48 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组 0.87±0.09 0.33±0.03 0.24±0.02 0.42±0.04 89.94±8.34 12.33±1.18 t 值 12.211 9.731 12.324 8.908 7.488 9.145 P值＜0.001 0.001＜0.001 0.001 0.002 0.001

表4 过表达HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞中IL-1和IL-6表达的影响（±s，n = 3）

表4 过表达HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞中IL-1和IL-6表达的影响（±s，n = 3）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与ox-LDL组比较,bP ＜0.05；与ox-LDL+pcDNA3.1组比较，cP ＜0.05；n为实验重复次数

分组 IL-1（ng/L）IL-6（ng/L）对照组 326.14±34.59 19.25±2.11 ox-LDL组 792.34±59.37a 53.67±4.65a ox-LDL+pcDNA3.1组 802.21±60.18a 55.21±5.10a ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组 446.25±46.84bc 25.64±2.65bc F值 200.722 212.214 P值＜0.001＜0.001

四、HOXA-AS2靶向调控miR-17

Starbase数据库预测显示HOXA-AS2 与miR-17存在结合位点（图3）。荧光素酶报告实验显示，与miR-NC组比较，miR-17组中转染野生型表达载体WT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性降低（t= 11.281，P＜0.05），而转染突变型表达载体MUT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-17组中转染野生型表达载体WT-HOXAAS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性升高（t= 9.606，P＜0.05），而转染突变型表达载体MUT-HOXAAS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（表5）。miR-17表达水平比较，pcDNA3.1-HOXA-AS2组（0.34±0.03）比pcDNA3.1组（1.04±0.10）降低，si-HOXA-AS2组（2.14±0.22）比si-NC组（0.99±0.10）升高（P均＜0.05）。

五、过表达miR-17能逆转HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞增殖、凋亡及IL-1和IL-6表达的影响

与ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组比较，ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组和ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组EA.hy926细胞中P21、cleaved caspase 3、caspase 3表达水平和细胞凋亡率降低，IL-1和IL-6水平和细胞增殖率升高（P＜0.05），ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组和ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组之间各指标差异无统计学意义（图4，表6～7）。

图3 HOXA-AS2靶向miR-17

表5 双荧光素酶报告实验对HOXA-AS2和miR-17靶向关系的验证（±s，n = 3）

表5 双荧光素酶报告实验对HOXA-AS2和miR-17靶向关系的验证（±s，n = 3）

注：与miR-NC组比较，aP ＜0.05；与anti-miR-NC组比较，bP ＜0.05；n为实验重复次数

分组 WT-HOXA-AS2 MUT-HOXA-AS2 miR-NC组 1.01±0.10 0.94±0.09 miR-17组 0.33±0.03a 1.02±0.10 anti-miR-NC组 1.00±0.10 1.01±0.10 anti-miR-17组 2.29±0.21b 0.99±0.10 F值 123.931 0.399 P值＜0.001 0.758

图4 过表达miR-17 在HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞增殖、凋亡中的影响

表6 过表达miR-17能逆转HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞中IL-1和IL-6表达及细胞增殖率的影响（±s，n = 3）

表6 过表达miR-17能逆转HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞中IL-1和IL-6表达及细胞增殖率的影响（±s，n = 3）

注：与ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组比较，aP ＜0.05；与ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组比较，bP ＜0.05；n为实验重复次数

分组细胞增殖率（﹪）IL-1（ng/L）IL-6（ng/L）ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组 90.23±9.24 452.01±42.96 26.14±2.42 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组 90.21±9.16 451.21±43.58 26.11±2.39 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组 53.67±5.46ab 684.26±62.38ab 41.29±4.37ab F值 20.130 21.265 22.499 P值 0.002 0.002 0.002

表7 过表达miR-17能逆转HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞中P21、cleaved caspase 3、caspase 3 及凋亡率的影响（±s，n = 3）

表7 过表达miR-17能逆转HOXA-AS2对ox-LDL作用的EA.hy926细胞中P21、cleaved caspase 3、caspase 3 及凋亡率的影响（±s，n = 3）

注：与ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组比较，aP ＜0.05；与ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组比较，bP ＜0.05；n为实验重复次数

分组 P21 cleaved caspase 3 caspase 3 凋亡率（﹪）ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组 0.31±0.03 0.26±0.02 0.41±0.04 12.55±1.35 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组 0.32±0.03 0.27±0.02 0.42±0.04 12.63±1.42 ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组 0.73±0.07ab 0.56±0.05ab 0.79±0.07ab 23.31±1.95ab F值 77.149 79.182 52.111 45.119 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

讨 论

AS属于常见的血管病变，有着较高的发病率与死亡率，尽早诊断与治疗对于改善患者的预后，提高生活质量有着积极的意义[12]。血管炎症、内皮细胞功能损伤与障碍均与AS密切相关，深入研究其相关机制对防治AS以及进一步防治相关疾病意义重大[13]。研究显示，内皮细胞功能损伤可促使多种炎性因子的分泌及粥样斑块形成[14]。炎性相关因子也参与了AS的形成发展过程，AS模型大鼠血清中白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）高表达[15]。本实验用ox-LDL作用人脐静脉内皮细胞株EA.hy926结果显示，细胞增殖率降低，细胞凋亡率、IL-1、IL-6水平升高。说明ox-LDL 可导致内皮细胞损伤和炎症因子的释放，表明AS细胞模型建立成功。

研究发现lncRNA 参与调节AS的发生发展[16]。敲低HOXA-AS2 可通过抑制细胞增殖并加速凋亡来抑制乳头状甲状腺癌的进展[17]。敲低HOXAAS2抑制肝细胞癌增殖，并促进细胞凋亡[18]。本研究结果显示，ox-LDL作用的EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平降低，然而HOXA-AS2对AS的影响尚未可知。本实验通过转染HOXA-AS2过表达载体至ox-LDL作用的EA.hy926细胞中，研究HOXA-AS2对AS细胞模型的增殖、凋亡和炎性因子的影响，结果显示，ox-LDL作用的EA.hy926细胞中P21、cleaved caspase 3、caspase 3表达水平、细胞凋亡率降低，细胞增殖率升高，IL-1、IL-6水平降低。说明过表达HOXA-AS2 促进EA.hy926细胞增殖，抑制ox-LDL作用的EA.hy926细胞凋亡和炎症因子的产生。

有研究显示，过表达miR-17 可通过靶向胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）促进细胞增殖并抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡[19]。抑制miR-17-5p 可以通过减轻AS小鼠主动脉的炎症反应和氧化应激水平缓解AS 病变[20]。说明miR-17具有调节细胞凋亡和炎症反应的作用。此外，还有研究报道LncRNA SNHG16通过miR-17-5p/NF-κB信号通路促进AS患者巨噬细胞的增殖和炎症反应[21]。说明lncRNA可通过调控miR-17影响细胞的生物学行为，本实验用Starbase数据库预测显示HOXA-AS2与miR-17存在结合位点，进一步通过双荧光素酶报告实验验证表明HOXAAS2 可靶向调控miR-17的表达。本实验结果显示，ox-LDL作用的EA.hy926细胞中miR-17高表达，同时过表达miR-17和HOXA-AS2后，P21、cleaved caspase 3、caspase 3表达水平、细胞凋亡率、IL-1和IL-6水平升高，细胞增殖率降低，说明过表达miR-17逆转了HOXA-AS2过表达对ox-LDL作用的EA.hy926细胞增殖、凋亡及炎性因子的影响，提示HOXA-AS2可能通过调控miR-17影响ox-LDL作用的EA.hy926细胞增殖、凋亡及炎性因子水平。

综上所述，过表达HOXA-AS2可促进细胞增殖，抑制ox-LDL作用的细胞凋亡和炎症因子的释放，其机制可能与miR-17有关。