蓝莓果酒的工艺优化及其抗氧化活性研究

梁 慧，卜坚珍，冯卫华 ，于立梅*，廖志强

(1.江门市第一职业高级中学 商旅部，广东 江门 529000 ; 2.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225)

蓝莓(Vaccinium Spp)又名笃斯越橘，属于杜鹃花科(Ericaceae)，越橘属(Vaccinium)，小果类果树品种之一，广泛分布于世界各地。蓝莓VC含量很高， 是苹果的几十倍，被誉为“浆果之王”。还富含维生素E、A、B1及SOD、熊果甙、花青甙、蛋白质、脂肪等其他果品中稀有的特殊成分及丰富的铁、锌、锰等微量元素，具有防止脑神经衰老、加强心脏功能、明目抗癌等独特功效，被联合国粮农组织确定为人类五大健康食品之一[1-4]。但是，蓝莓成熟期为每年的6—8月，由于气温比较高，常温长时间放置容易导致果实腐烂。因此，有必要对蓝莓鲜果进行深加工，以延长蓝莓制品的生产周期。随着国内消费市场的高速增长，蓝莓果酒的市场发展潜力巨大。陈亮等[5]研究了发酵期间蓝莓果酒总酚含量、花色苷含量、自由基清除率以及还原力的变化并进行相关性分析，结果证明，由于酵母菌的作用各项指标总体显现下降趋势。薛桂新等[6]研究了在发酵期间，不同蓝莓添加量的复合果酒的抗氧化活性有所差异。结果表明：蓝莓添加量为10%的复合果酒其抗氧化能力最佳，虽然目前对蓝莓果酒的抗氧化性活性的研究已有报道，但在蓝莓果酒工艺优化的基础上，对其发酵期间的抗氧化活性的研究上尚不多见。因此，以蓝莓为试材，通过对酵母(Saccharomyces)的发酵筛选，发酵参数的优化，生产出酒精度较低、口味酸甜度适宜的保健型含酒精饮品，并研究其抗氧化活性，为蓝莓酒的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

兔眼蓝莓购自树果悦浓水果旗舰店；安琪果酒专用酵母RV002、RW、SY、BV818、RV171，安琪酵母股份有限公司生产； 果胶酶(酶活力：26 000 PG/mL)，诺维信公司生产。

1.2 方法

1.2.1工艺流程

蓝莓→筛选、冲洗→粉碎匀浆→ 0.02%果胶酶酶解→酶失活→调节糖度、pH值→加入偏重亚硫酸钾→加入酵母菌→前期发酵→滤去果渣→后期发酵→澄澈→蓝莓果酒

1.2.2发酵单因素试验

1.2.2.1酵母种类对发酵的影响

选择RV002、RW、SY、BV818、RV171五种安琪葡萄酒专用酵母，35 ℃温水活化30 min。酵母接种量为0.8%(质量分数)，固定温度20 ℃，糖度20%，偏重亚硫酸钾添加量80 mg/L，pH值4.0，以酒精度(酒精体积分数)为评价指标确定酵母种类。

1.2.2.2酵母添加量对发酵的影响

选择0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%添加量，固定温度20 ℃，糖度20%，偏重亚硫酸钾添加量80 mg/L，pH值4.0，以酒精度为评价指标确定酵母添加量。

1.2.2.3偏重亚硫酸钾对发酵的影响

选取0、40、80、120、160 mg/L偏重亚硫酸钾添加量，固定温度20 ℃，糖度20%， pH值4.0，酵母添加量0.8%，以酒精度为评价指标确定偏重亚硫酸钾添加量。

1.2.2.4pH值对发酵的影响

选取pH值3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，固定发酵温度20 ℃，糖度20%，酵母接种量为0.8%，偏重亚硫酸钾添加量80 mg/L，以酒精度为评价指标确定pH值范围。

1.2.2.5初始糖度对发酵的影响

选取18%、20%、22%、24%、26%糖度，固定在温度20 ℃，酵母接种量为0.8%，偏重亚硫酸钾添加量80 mg/L，pH值4.0，发酵期限7天，把酒精度作为评判指标，确定初始糖度。

1.2.3主发酵多因素试验

温度为20 ℃，选择试验因素：初始糖度、SO2添加量、酵母添加量、pH值，采用L9(43)正交试验设计，把酒精度及感官评价当作评价指标，确定蓝莓果酒发酵工艺的最佳值。

1.3 指标测定

1.3.1酒精度检测

参考国标GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行操作[7]。

1.3.2感官评价的测定

参考国标GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行感官测定[7]。

1.3.3DPPH自由基清除能力测定

蓝莓酒的DPPH自由基清除能力参照CALLISTE等的方法在第1、3、5、7、9取样测定，以等量的超纯水当作空白对照[8]。

DPPH自由基清除率(%)=(1-As/A0) ×100%

其中：As为样品管的吸光值，A0为对照管的吸光值。

1.3.4FRAP值的测定

测定参照BENZIE[9]的方法，以EC1值作为样品铁还原能力评价指标，EC1值指与1 mmol/LFeSO4·7H2O有同等抗氧化能力的样品的量。

加入18 mg/L的硫酸0.25 mL，再加水稀释至50 mL定容，并置入小铁钉。于第1、3、5、7、9天测蓝莓果酒的FRAP值，以超纯水为空白对照，在593 nm下测定吸光度，记录数据。

1.4 数据处理与统计分析

数据分析和作图采用Excel 2007，以平均值±标准差作为试验结果。

2 结果与分析

2.1 蓝莓果酒发酵单因素试验

2.1.1酵母菌种类对蓝莓果酒酒精度的影响

果酒的酿造过程即酵母将果汁中的糖分转化为乙醇的过程，使果酒酒精度逐渐上升。5种酵母菌在发酵前期使果酒酒精度增加幅度较大，后期影响缓慢，最终趋于稳定。这可能是由于酵母菌繁殖至指数生长期后，菌体生长出现了衰弱现象，其将糖分转化为乙醇的能力下降，见表1[10-11]。

表1 酵母菌种类对蓝莓果酒酒精度的影响

由表1可知，随着发酵天数的增加，5种酵母菌发酵蓝莓酒精度在9.8%～13.8%。酵母RW发酵的酒精度较高，说明酵母RW较其他酵母利用蓝莓汁中糖类物质的能力较强，因此最终筛选出酿造蓝莓果酒的最佳酵母为RW。

2.1.2酵母添加量对蓝莓果酒酒精度的影响(见图1)

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

由图1可知，随着接种量的增加，酒精度呈先增后减的趋势，接种酵母的量为0.6%时，酒精度达到最大值14.8% ，与其他几组酒精度变化差异显著(P<0.05)。在较高接种量下，酒精产量下降。可能是因为合适的接种量有利于缩短发酵周期，提高果酒的质量，当接种量过大时，微生物繁殖需要发酵液中的营养物质，并在增殖过程中产生大量的代谢物质，导致细胞过早老化、自溶等，而不利于后期酒精发酵[8]。因此选择酵母添加量为0.4%～0.8%进行正交试验。

2.1.3偏重亚硫酸钾对蓝莓果酒酒精度的影响(见图2)

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

由图2可知，5个梯度的偏重亚硫酸钾添加量中，添加量为80 mg/L时其残糖量最低，酒精度达到最大14%。而添加量为0和160 mg/L时，残糖量最高，酒精度较低，果酒的风味不佳，略带苦涩。原因是SO2质量浓度过低时，杂菌易污染且易与酵母菌增长形成竞争作用，酵母菌将糖转化为酒精的能力较其他添加量弱，但是当SO2的浓度过高时，酵母菌无法处于适合的生长环境，自身的代谢活动会受到抑制，酵母菌将糖转化为酒精的效率也会偏低[12]。因此，选择偏重亚硫酸钾添加量为40～120 mg/L进行正交试验。

2.1.4pH值对蓝莓果酒酒精度的影响(见图3)

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

由图3可知，当pH值为4.5时，蓝莓发酵果酒的酒精度达到最大，体积分数为13.8%。pH值为3.0时，发酵后的蓝莓果酒酒精度偏低，而pH值为5.0时，主发酵7天后，耗糖量最少且酒精度最低。因为酸会影响酵母的生长速度，酵母本身有一个最适pH值的生长环境。pH值过低或过高都会抑制酵母的生长，从而降低糖类转化为酒精的效率。综合上述原因，选择pH值为3.5～5.0。

2.1.5初始糖度对蓝莓果酒酒精度的影响(见图4)

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

由图4可知，在主发酵阶段的前3天中，初始糖量越大，糖分消耗得越快，而4天后，消耗糖分的速度减慢。初始糖含量高，有利于微生物生长代谢，酒精度升高，虽然微生物的生长需要足够的碳源和氮源等营养物质，但如果糖含量呈现富余状态，造成培养液的渗透压过大，会使微生物细胞快速脱水，打破微生物的代谢稳定，造成细胞的活力下降，不利于其生长与发酵。同时过多的糖分会影响果酒的风味和消费者的接受程度[13]。因此选择糖添加量20%～24%。

2.2 主发酵工艺参数在蓝莓果酒中的优化

依据单因素试验结果设计，正交试验结果如表2所示。

表2 发酵工艺的正交试验结果

由表2可知，根据蓝莓发酵酒酒精度的程度为A>C>D>B，即初始糖度>酵母接种量>pH值>偏重亚硫酸钾，理论最佳组合为A3B1C3D1，实验组中最优为A3B1C3D2，因此需要进行验证实验，经过验证实验得到A3B1C3D2组合酒精度体积分数最高，因此最佳发酵工艺方案为A3B1C3D2，即含糖量为24%，偏重亚硫酸钾添加量为40 mg/L，酵母接种量为0.8%，pH值为4.0时，即为蓝莓果酒的最佳工艺条件。

2.3 蓝莓果酒的抗氧化活性

2.3.1蓝莓果酒发酵期间的DPPH自由基清除活性(见图5)

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

由图5可知，蓝莓果酒第1天 DPPH自由基清除率为44.4%，其随着储藏天数的增加，清除率逐渐降低，抗氧化能力也随之降低，7天后逐渐趋于稳定，清除率稳定在15%左右，9天后，自由基清除能率降低了29%，下降趋势显著。研究表明，发酵过程中果酒中花色苷和总酚含量会下降，导致活性下降[14-15]。可能由于活性酵母发酵产生大量次级代谢产物与花色苷及总酚反应生成衍生物，或花色苷的水解[16]。蓝莓受到微生物酶的影响，其细胞壁分离同时放出蛋白质、糖苷等成分，除此之外，以及DPPH自由基清除能力也受到发酵液pH值、乙醇浓度及温度等的影响，使其呈现下降的趋势。

2.3.2蓝莓果酒发酵期间的FRAP值(见图6)

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

由图6可知，利用FRAP法测定蓝莓发酵液的抗氧化活性呈下降的趋势，第1 天的FRAP值69.1 mmol/L，第9天35.4 mmol/L，总体下降了33.7 mmol/L。试验表明：蓝莓果酒随着储藏时间的增加，其FRAP值逐渐减小，抗氧化能力下降。王秀菊[17]研究了蓝莓总酚、花色苷及抗氧化活性，发现蓝莓的FRAP值、DPPH自由基清除力以及总酚含量具有极显著相关性，但与花色苷含量相关性不显著。由此可见，蓝莓果酒的抗氧化活性与多酚物质有关。许多研究验证，随着果酒储藏过程的延长，存在果酒中的一些主要游离态酚酸和单体酚含量都呈差异性下降趋势，能够生成酚酸衍生物和花色苷衍生物[18]。花色苷组分的减少是导致其还原力下降的根本原因。

3 结论

在单因素试验的基础上，通过正交试验获得蓝莓果酒的工艺参数为：最佳菌种酵母菌RW，初始糖量24%，偏重亚硫酸钾含量40 mg/L，酵母添加量0.8%，pH值为4.0。该工艺制作出的蓝莓果酒颜色为紫红色；澄清明澈，香味地道且甘甜醇厚的口味，具有蓝莓果酒突出的典型风格。运用DPPH法和FRAP法测定蓝莓果酒的抗氧化能力，结果显示，随着发酵时间的延长，蓝莓果酒的氧化活性逐渐降低，最终趋于稳定。王鹤霖等[19]也发现蓝莓籽瓜果酒，随着发酵时间的延长，其抗氧化活性后期较稳定；也与薛桂新[6]研究的蓝靛果蓝莓复合果酒抗氧化结果相似；为后期果酒发酵参数优化、分析以及营养保健方面提供了参考价值。