朱 淼,侯怡铃,唐 贤,宋志强,丁 祥
(1.西华师范大学生命科学学院,西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充 637009;2.西华师范大学环境科学与工程学院,四川南充 637009)
T 细胞是起源于骨髓干细胞,在胸腺激素的作用下成熟分化于胸腺的一种免疫细胞,根据表面具有的CD4、CD8 分子将其分为CD4+T 辅助淋巴细胞、CD8+T 免疫淋巴细胞两大亚类[1],CD4+亚类中的Th1 细胞(辅助性T 细胞1 型) 可以通过分泌细胞因子 (IFN-γ) 介导细胞免疫,Th2 细胞(辅助性T 细胞2 型) 则通过分泌IL-4 等细胞因子辅助B 淋巴细胞产生抗体介导体液免疫;CD8+亚群的T 细胞通过分泌穿孔素等物质直接杀伤靶细胞,从而发挥其细胞免疫活性[2-3]。T 细胞能参与体液免疫和细胞免疫,在免疫调节中具有重要的作用。
真菌多糖是从真菌菌丝体、子实体和发酵液中提取的一种生物大分子,具有免疫调节、抗炎症、抗肿瘤等活性,被认为是最有效的免疫调节剂[4]。20 世纪50 年代,日本学者关于香菇多糖具有抗肿瘤活性的报道引起了研究人员的关注,越来越多的真菌多糖,如灵芝多糖、姬松茸多糖、香菇多糖已被证明具有显著的免疫增强作用[5-7]。
松茸Tricholoma matsutake是口蘑属外生菌根真菌,具有独特的浓郁香味,为我国二级濒危保护物种,也是世界上珍稀名贵的天然药用菌,其多糖被认为是有价值的药物[8]。课题组前期从采自于四川马尔康的松茸中提取出了一种结构新颖的多糖TMP-A (图1),能促进T 细胞(Jurkat 细胞株)的增殖[9],但相关机制仍不清楚。因此,本实验借助RNA-seq 测序技术将空白对照组、TMP-A 药物组、LPS 阳性对照组的T 细胞转录组进行测序,分析TMP-A 药物组相比于空白对照组的T 细胞差异表达基因(DEGs),探究诱导其增殖的基因及信号通路以确定相关机制。
1.1 药物 松茸Tricholoma matsutake采自四川省马尔康市,保存于四川省南充市西华师范大学生命科学学院西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,其多糖(TMP-A) 按照参考文献[10]报道的方法制备。
1.2 细胞株 T 细胞(Jurkat 细胞株) 购于中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞所。
图1 TMP-A 结构Fig.1 TMP-A structure
1.3 试剂及仪器 RPMI1640 培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、双抗、Trizol 均购自美国Gibco 公司;脂多糖(LPS) 购自美国Sigma 公司;-80 ℃超低温冰箱、3111 型CO2细胞培养箱、SE-CJ-IF 型超净工作台均购自美国Thermo scientific公司。
2.1 细胞培养 复苏冻存于-80 ℃的T 细胞并培养,借助血球计数板配置细胞浓度为5×104/mL 的细胞悬液[9],每孔1 mL 接种于6 孔培养板上,于5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养24 h,在空白对照组中加入1 mL 细胞培养液,TMP-A 组每孔中加入1 mL TMP-A (细胞完全培养液配制,终质量浓度10 μg/mL),LPS 阳性对照组中加入1 mL LPS溶液(终质量浓度为10 μg/mL),继续培养24 h,每组3 个重复。将每孔中T 细胞保存于1 mL TRIzol 中。
2.2 样品质量检测 将保存于TRIzol 中的T 细胞冷冻邮寄至诺禾致源公司,对其RNA 进行提取,并通过以下4 种方法对RNA 样品进行检测:(1)琼脂凝胶电泳分析RNA 降解程度及是否有污染;(2) Nanodrop 检测RNA 纯度(OD260/OD280);(3)Qubit 对RNA 浓度进行精确定量;(4) Aglient 2100 精确检测RNA 完整性。样品检测合格后构建cDNA 文库,库检合格后上机测序。
2.3 数据处理 测序完成后,原始序列(Raw reads) 去除带接头、含有N (N 表示无法确定碱基信息) 大于10% 序列 (reads)、低质量序列(reads) (Q phred ≤20 的碱基数占整个read 长度50%以上的reads),获得用于后续分析的分析序列(Clean reads),借助HISAT 软件[11]将其进行基因组定位分析,利用HTseq 软件中的union 模型[12]进行基因表达分析;采用DESeq 软件[13]进行差异基因表达的分析,借助GOseq[14]和KOBAS (2.0)[15]对差异基因进行GO 富集和KEGG 富集分析。
3.1 测序数据质量评估 将测序得到的原始序列过滤后,空白对照组、TMP-A 组和LPS 阳性对照组分别得到46 574 489、50 259 600、57 439 600 条Clean reads,对应的总大小分别为6.99、7.54、8.62 G。从表1 中可得出,碱基的测序错误率控制在0.02%,空白对照组、TMP-A 组、LPS 阳性对照组Q20 所占的比例分别为96.19%、95.87%、95.52%,Q30 分别为90.84%、90.25%、89.47%,而且GC 含有量在各样本中基本保持不变。参考序列比对发现,每个组比对到基因组中的读段数都超过了90%,见表2。
表1 转录组测序数据质量评估Tab.1 Quality assessment for sequencing data of transcriptome
表2 Clean reads 在参考基因组不同区域的分布Tab.2 Clean reads distribution in different regions of reference genome
3.2 基因表达分析 FPKM 大于60 的基因被认为是高表达的,FPKM 在0~1 区间的基因被认为是低表达或不表达。表3 显示,3 组基因表达水平分布相似;空白对照组中有15 373 个基因表达,占总数的26.10%,2 803 个高表达(FPKM>60),约占总数的4.77%;TMP-A 组有16 847 个基因表达,占总数的28.60%,2 822 个高表达,约占总数的4.79%;LPS 阳性对照组中有15 831 个基因表达,占总数的26.87%,2 819 个高表达,约占总数的4.79%。
进一步分析发现,空白对照组、TMP-A 组、LPS 阳性对照组分别有9、10、5 个基因超高表达(FPKM>2 000),空白对照组的为MT-CO2、MTCO3、Eef2、Actb、Calr、MT-CO1、Ptma、Eef1a1、MT-ATP6(表4),TMP-A 组的为MT-CO2、MT-CO3、Eef2、Actb、hnRNPA1、Calr、MT-CO1、Ptma、Eef1a1、MT-ATP6(表5),LPS 阳性对照组的为MT-CO1、MT-CO2、Eef2、Actb、Eef1a1(表6)。
表3 不同表达水平区间的基因数量统计[个(%)]Tab.3 Quantitative statistics of genes in different expression level intervals [n (%)]
Eef1a1 为编码真核翻译延长因子的基因[16],该基因在3 组中均呈高表达,说明T 细胞增殖过程中蛋白质的合成增强。MT-CO1、MT-CO2、MTCO3 分别编码细胞色素c 氧化酶的亚基Ⅰ、亚基Ⅱ、亚基Ⅲ,MT-ATP6 编码的线粒体ATP 合酶是氧化磷酸化的关键酶,MT-CO1、MT-CO2、MTCO3、MT-ATP6 基因在空白对照组组、TMP-A 组超高表达,说明在TMP-A 的作用下氧化磷酸化所产生的能量仍然是T 细胞增殖过程的主要能量来源。Calr基因表达的钙网蛋白能够维持Ca2+稳态[17],在空白对照组、TMP-A 组超高表达,提示在TMP-A 的作用下T 细胞在增殖过程中仍然主要是通过钙网蛋白的高表达来调节细胞运动、蛋白质合成及线粒体代谢,协助蛋白质的正确折叠以确保细胞的存活。hnRNP 家族的异质性胞核核糖核蛋
白A1 基因(hnRNPA1)[18]仅在TMP-A 组高表达,提示TMP-A 具有增强RNA 代谢的功能。同时,Actb基因在TMP-A 组和LPS 阳性对照组的表达都低于空白对照组,Actb为β 肌动蛋白基因,能够编码肌动蛋白的形成[19],提示T 细胞在TMP-A 和LPS 作用下细胞结构和细胞分裂活动具有相似的变化。
表4 空白对照组中基因的定量表达(FPKM>2 000)Tab.4 Quantification of gene expressions in the blank control group (FPKM>2 000)
表5 TMP-A 组中基因的定量表达(FPKM>2 000)Tab.5 Quantification of gene expressions in the TMP-A group (FPKM>2 000)
表6 LPS 阳性对照组中基因的定量表达(FPKM>2 000)Tab.6 Quantification of gene expressions in the LPS positive control group (FPKM>2 000)
3.3 差异基因表达分析 采用DESeq 进行差异基因(DEGs) 表达分析,以Pvalue <0.05 和fold change≥1 为差异基因的筛选标准。结果显示,TMP-A 组相比于空白对照组有485 个基因显著差异表达,482 个上调,3 个下调(图2),其中差异倍数较大的10 个上调基因为Matk、Mlxipl、Zfr2、Ctrb1、Agxt、Exd3、Smtnl2、Entpd8、Crocc2、Sbk3(表7);LPS 阳性对照组相比于空白对照组有1 512个基因显著差异表达,1 441 个上调,71 个下调(图3),其中差异倍数较大的10 个上调基因为Entpd8、Agxt、Matk、PPR18、Ctrb1、Exd3、Zfr2、Smtnl2、Sod3、Syt8 (表8)。
图2 TMP-A 组相比于空白对照组基因差异表达分析火山图Fig.2 Volcanic map analysis of DEGs of the TMP-A group vs the blank control group genes
表7 TMP-A 组相比于空白对照组差异基因的表达Tab.7 DEGs of the TMP-A group vs the blank control group
图3 LPS 阳性对照组相比于空白对照组基因差异表达分析火山图Fig.3 Volcanic map analysis of DEGs of the LPS positive control group vs the blank control group genes
进一步分析发现,Agxt,Entpd8,Exd3,Matk,Ctrb1,Zfr2,Smtnl2 在TMP-A、LPS 作用下都呈差异表达。Agxt为编码丙氨酸乙醛酸转氨酶的基因,能使乙醛酸转化生成甘氨酸[20],该基因表达上调,提示TMP-A、LPS 能够通过增强甘氨酸的生成促进T 细胞的增殖,合成T 细胞参与免疫反应需要的蛋白质;核苷三磷酸二磷酰水解酶(NTPDASE) 家族的基因Entpd8 编码的是一种与质膜紧密结合的外酶[21],能将三磷酸核苷和二磷酸核苷水解为单磷酸核苷,说明TMP-A、LPS 可通过增加体内核苷酸/核苷的浓度来影响p2 受体的信号传导。Exd3 为编码包含3 的核酸外切酶3′-5′结构域的基因[22],提示TMP-A、LPS 通过上调该基因的表达确保DNA 复制的准确性和催化DNA 延伸。Matk基因编码CSK 激酶家族的巨核细胞相关酪氨酸激酶MATK[23],该基因上调提示TMP-A、LPS 能抑制SRC 蛋白酪氨酸激酶的异常激活,调节依赖于SRC 蛋白酪氨酸激酶活性的RAF/MAPK通路的传导。基因Mlxipl、Crocc2、Sbk3 仅在TMP-A作用下呈差异表达,Mlxipl为编码碳水化合物反应元件结合蛋白(CHREBP) 的基因[24-25],提示TMPA 能调节与葡萄糖和脂质代谢相关的基因转录。基因Syt8 仅在LPS 作用下呈差异表达,作为编码突触结合蛋白的成员之一[26],它是Ca2+感受器;与LPS作用机制不同,TMP-A 并不是通过突触结合蛋白来调节T 细胞内神经递质的释放和信号传导过程,提示TMP-A、LPS 具有相似的诱导Jurkat 细胞增殖的机制,同时也存在一定的差异。
表8 LPS 阳性对照组相比于空白对照组差异基因的表达Tab.8 DEGs of the LPS positive control group vs the blank control group
3.4 差异基因GO 分析 GO 是在生物信息领域乃至整个生物领域中广泛使用的分类系统,主要包括3 个分支,即细胞组分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Funtion) 和生物过程(Biological Process)。将TMP-A 组相较于空白对照组的485 个差异基因进行GO 分析,结果有302 个在GO 中成功进行了注释。然后以Corrected-Pvalue<0.05 为标准进行筛选,得到在GO 中出现了富集的差异基因。在TMP-A 组的差异基因显著富集到了66 条GO 基因门类中,包括多细胞有机体过程、离子转运、离子跨膜运输、肌肉系统过程、离子稳态调节等36 条生物过程(Biological Process),细胞膜的组成等10 条细胞组分(Cellular Component),参与离子通道活性、跨膜转运蛋白活性等20 条分子功能(Molecular Funtion)。同时,生物过程(Biological Process) 中的离子转运和系统过程、细胞组分(Cellular Component) 中的细胞外周和质膜、分子功能(Molecular Funtion) 中转运活性是富集最显著的GO 基因门类(图4)。LPS 阳性对照组相较于空白对照组的差异基因GO 富集结果显示,生物过程中的繁殖(reproduction) 是LPS 诱导T 细胞增殖的关键基因门类(图5)。由此提示,与LPS 作用机制所涉及的关键基因门类不同,TMP-A 并不是通过影响其繁殖能力直接诱导T 细胞增殖。
3.5 差异基因KEGG 分析 KEGG 是系统分析基因功能、基因组信息数据库,它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究,本实验借助它对TMP-A 组与空白对照组的差异基因富集通路进行分析。结果显示,TMP-A、LPS 相比于空白对照组的差异基因都在代谢途径、神经活性配体-受体相互作用、Ras 信号途径、MAPK 信号途径等多条通路中显著富集(表9~10) 中。LPS 与空白对照组相比,差异基因还在cAMP 信号通路和钙信号通路出现了富集,提示与LPS 不同,TMP-A 诱导T 细胞增殖的因素不涉及细胞内第二信使。
图4 TMP-A 相比于空白对照组差异基因GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs of the TMP-A group vs the blank control group
图5 LPS 阳性对照组相比于空白对照组差异基因GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of DEGs of the LPS positive control group vs the blank control group
Ras-Raf-Erk-MAPK 信号途径是目前研究得比较清楚的一条信号通路,信号分子与受体结合后,经下游一系列传导过程将信号传递给靶基因,从而调节细胞的增殖、生长和发育等生物学过程(图6)。TMP-A 与空白对照组相比,富集在Ras-Raf-Erk-MAPK 信号途径的差异基因均为上调基因(图6 中边框标注),例如成纤维生长因子基因家族的Fgf2、Fgf3,磷脂酶A2 基因家族的Pla2g4f、Elk1等。LPS 相较于空白对照组,富集在Ras 信号通路的上调基因也包括Fgf2 和Pla2g4f等,但钙调蛋白家族的基因Calml5 在该通路下调。TMP-A 组相比于空白对照组,上调的差异基因也在代谢途径、神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt 信号通路中出现了富集,提示在TMP-A 作用下T 细胞中的生物代谢过程及信号传导过程都得以增强。
表9 TMP-A 组与空白对照组差异基因KEGG pathway 富集分析Tab.9 KEGG pathway enrichment analysis of DEGS of the TMP-A group vs the blank control group
表10 LPS 阳性对照组与空白对照组差异基因KEGG pathway 富集分析Tab.10 KEGG pathway enrichment analysis of DEGS of the LPS positive control group vs the blank control group
本研究以T 细胞(Jurkat 细胞株) 为研究对象,采用RNA-seq 转录组测序技术对松茸多糖(TMP-A) 组和空白对照组中的T 细胞进行测序并进行生物信息学分析。结果表明,氧化磷酸化是T细胞增殖过程中的主要能量来源,而且TMP-A 对T 细胞无毒性,不影响细胞的正常代谢。差异基因分析显示,在TMP-A 的作用下,与T 细胞增殖的相关代谢过程明显加强,而且生物过程(Biological Process) 中的离子转运和系统过程、细胞组分(Cellular Component) 中的细胞外周和质膜及分子功能(Molecular Funtion) 中的转运活性是TMP-A促进T 细胞增殖的主要基因门类。同时,还筛选出了TMP-A 诱导T 细胞增殖的相关信号途径,包括Ras 信号途径、MAPK 信号途径、细胞因子-细胞因子-受体相互作用、PI3K-Akt 信号途径等。
图6 Ras-Raf-Erk-MAPK 信号通路Fig.6 Ras-Raf-Erk-MAPK signaling pathway
MAPK 信号途径是在真核细胞中存在的一种高度保守的信号转导模式,通过激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Raf-1 (MAPKKK)、磷酸化MEK 蛋白激酶(MAPKK) 和MAPK (促分裂原活化蛋白激酶) 将有丝分裂信号传递到细胞核内,进而调控细胞的生长、分化和增殖等重要生理功能[27]。在Ras-Raf-Erk-MAPK 信号途径中,成纤维生长因子家族基因的Fgf2[28]表达上调,提示TMP-A 对于维持骨髓微环境,调控细胞的分化具有重要作用;上调磷脂酶基因家族 PLA 中的Pla2g2e、Pla2g3[29-31],表明TMP-A 能够调节T 细胞的新陈代谢、增强T 细胞参与炎症和防御反应的能力。Elk1 为ETS 转录因子ELK1 基因[32-34],该基因表达上调,表明TMP-A 诱导下T 细胞产生的炎症相关因子IL-1β 和TNF-α 增多。Grin2b基因编码的NR2B 是NMDA 受体(一种神经递质通道) 的亚单位之一[35],该基因表达上调,提示在TMP-A 作用下,T 细胞对刺激做出反应的能力增强。综上所述,TMP-A 通过上调成纤维生长因子家族(FGF)激活受体酪氨酸激酶RTK、下游Ras 蛋白,进而磷酸化MAPK 信号通路,提示它主要通过Ras-Raf-Erk-MAPK 信号途径诱导T 细胞增殖。