黄精九蒸九晒炮制过程中糖类成分动态变化

郑晓倩 金传山 *张亚中刘军玲李 雷许凤清

（1.安徽中医药大学，安徽合肥 230012； 2.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，安徽合肥 230012；3.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051； 4.金寨森沣农业科技开发有限公司，安徽六安 237000）

2015 年版《中国药典》 一部规定，黄精来源于百合科植物滇黄精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黄精P.sibiricumRed.或多花黄精P.cyrtonemaHua 的干燥根茎［1］，其中多花黄精具有极高的药用价值和经济价值［2］，含有甾体皂苷、黄酮、多糖等成分［3-5］，并且糖类在免疫调节［6］、抗菌、抗氧化、抗病毒等方面的活性引起广泛关注［6-8］。黄精生品具有刺激性，能“戟人咽喉”，蒸晒后方可入药，历代炮制方法以蒸煮为主，本草大多记载九蒸九晒炮制法。黄精在蒸晒的过程中不仅外观和口感发生很大的变化，其物质基础和药效也有明显改变［9-11］，已有学者对其炮制方法进行了优化和改进，但对九蒸九晒的机理尚不清楚。

为了初步探讨黄精九蒸九晒后糖类变化，本研究以果糖、葡萄糖、蔗糖为对照，采用TLC 法对生品及炮制品中该类成分进行定性研究，紫外-可见分光光度法来探究其含有量总动态变化，高效液相色谱-电喷雾检测器 （HPLC-CAD） 法监测单糖（果糖、葡萄糖）、双糖（蔗糖） 含有量动态变化，以期考证药材炮制机理，为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 UV-2700 紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；自动TLC 采样器、TLC 可视化仪（瑞士Camag 公司）；Ultimate 3000 液相色谱仪（配置Corona Ultra 电雾式检测器，美国Dionex 公司）；ML204 分析天平 （万分之一）、XP26 分析天平（百万分之一）（瑞士Mettler-Toledo 公司）；S120H超声波清洗机（德国Elma 公司）；Simplicity-185超纯水仪（美国Millipore 公司）；FD240 电热恒温干燥箱（德国Binder 公司）。

1.2 试剂与药物 果糖（批号100231-201305，纯度99.7%）、D-无水葡萄糖（批号110833-200904，纯度99.9%）、蔗糖（批号111507-201303，纯度99.8%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为质谱纯；乙醇、正丁醇、乙酸、丙酮、α-萘酚等均为分析纯；黄酒（安徽海神黄酒集团有限公司）；水为超纯水（自制）。

黄精由安徽省青阳县森沣农业科技有限公司提供，经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备 取生品3 份，除去泥土、须根等杂质，洗净，用20% 黄酒拌匀润透，置蒸锅中隔水蒸3 h，取出烘至半干，如此反复9 次，最终60 ℃恒温干燥，即得。每蒸、烘1 次后，留取3份平行样品。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取果糖、葡萄糖、蔗糖对照品，50%乙醇稀释成每1 mL 分别含三者5.006 4、5.128 5、5.448 3 mg，即得。

2.2.2 供试品溶液［12］取各炮制品粉末约1 g，加50%乙醇50 mL，静置1 h，水浴回流提取1 h，滤过，减压回收溶剂，加5 mL 50%乙醇溶解残渣，即得。

2.3 色谱条件［12］吸取对照品、供试品溶液各2 μL，点于同一硅胶G 薄层板上（含3 mmol／L磷酸二氢钠），以正丁醇-乙酸-丙酮-水（9∶4∶5∶2） 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 （α-萘酚） -硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。

2.4 样品分析 取各炮制品粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下检测。

2.5 多糖含有量测定

2.5.1 对照品溶液制备 取经105 ℃干燥至恒定质量的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL 含无水葡萄糖0.331 02 mg）。

2.5.2 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于10 mL 具塞试管中，加水至2.0 mL，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，摇匀，放冷后置于水浴中保温10 min，取出，立即置于冰水浴中冷却10 min，取出，以相应试剂为空白，在582 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），浓度为横坐标（X） 进行回归，得方程为A＝41.016X＋0.146 5 （R2＝0.999 5），在3.31～19.68 μg／mL范围内线性关系良好。

2.5.3 多糖提取液制备 取各炮制品粉末约0.25 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加80%乙醇150 mL，置于水浴中加热回流1 h，趁热过滤，残渣用80%热乙醇洗涤3 次，每次10 mL，将残渣及滤纸置于烧瓶中，加150 mL 水，置于沸水浴中加热回流1 h，趁热过滤，滤液放冷至室温，转移至250 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.5.4 样品含有量测定 精密量取多糖提取液1 mL，置于10 mL 具塞干燥试管中，按“2.5.2”项下方法计算。

2.6 单糖（果糖、葡萄糖）、双糖（蔗糖） 含有量测定

2.6.1 对照品溶液制备 取果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖对照品适量，精密称定，置于10 mL 量瓶中，80%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得（四者质量浓度分别为5.731 8、5.003 0、5.616 8 mg／mL）。

2.6.2 供试品溶液制备 取各炮制品粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加30 mL 80%乙醇超声（500 W、30 kHz） 处理60 min，滤过，减压回收溶剂，75% 乙腈溶解残渣，定容至100 mL 量瓶中，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得，进样3 μL 测定。

2.6.3 色谱条件 Shodex Asahipak NH2P-50 4E 色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -水（B） （75∶25）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃。CAD 检测器，数据采集频率5 Hz；滤光片3.6 F；雾化器温度35 ℃；气源N2；压力4.328×105Pa。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.4 线性关系考察 精密量取“2.6.1”项下对照品溶液，在“2.6.3”项色谱条件下进样。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6.5 检测限与定量限 取“2.6.1”项下对照品溶液逐步稀释，在“2.6.3”项色谱条件下进样。结果，当信噪比为3∶1 时，果糖、葡萄糖、蔗糖检测限分别为4.984 × 10-3、1.137 × 10-2、8.776×10-3mg／mL；为10∶1 时，三者定量限分别为1.415×10-2、3.521×10-2、2.617×10-2mg／mL。

2.6.6 精密度试验 取同一份生品，按“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，取3 μL，在“2.6.3”项色谱条件下连续进样6 次，测得3 种糖类峰面积RSD 分别为0.3%、1.2%、0.8%，表明仪器精密度良好。

2.6.7 稳定性试验 取同一份生品，按“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.6.3”项色谱条件下于0、2、4、8、16、24 h 进样测定，每次3 μL，测得3 种糖类峰面积RSD 分别为0.6%、1.3%、1.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.8 重复性试验 取同一份生品，按“2.6.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.6.3”项色谱条件下进样3 μL，测得3 种糖类含有量RSD 分别为0.5%、1.9%、1.2%，表明该方法重复性良好。

2.6.9 加样回收率试验 取各糖类含有量已知的同一批生品约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，平行6 份，分别精密加入8.120 2 mg／mL 果糖对照品溶液、2.826 3 mg／mL 葡萄糖对照品溶液、3.214 6 mg／mL蔗糖对照品溶液2.5、2、5 mL，按“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.6.3”项色谱条件下进样3 μL 测定，计算回收率，结果见表2。

2.6.10 样品含有量测定 取各炮制品粉末，按“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.6.3”项色谱条件下进样3 μL 测定，计算含有量。

2.7 结果

2.7.1 TLC 鉴别 见图2。

由此可知，在单糖部位（以果糖、葡萄糖对照品为参考，主斑点向上Rf较大的区域） 九蒸九晒品斑点比生品多且大，即生品经炮制后生成了较多的单糖；在低聚糖位置（以蔗糖对照品为参考，主斑点向下Rf较大的区域） 与生品相比，一蒸一晒、二蒸二晒品斑点明显增多变大，而三蒸三晒后明显减小，说明九蒸九晒对单糖、低聚糖成分影响较大。

2.7.2 含有量测定 以干燥品计算，见表3、图3。

表3、图3A 显示，果糖含有量随着蒸晒次数增加而升高，在第五蒸达到峰值后呈下降趋势；葡萄糖含有量随着炮制蒸晒次数增加而先升后降，在第七蒸到达峰值后下降；蔗糖含有量随着炮制时间延长先呈升高趋势，在第二蒸达到峰值后逐渐下降，在六蒸六晒品中已无法检出。

表3、图3B 显示，生品中多糖含有量为11.82%，经九蒸九晒后总体呈下降趋势，从生品到五蒸五晒品更明显，之后趋于稳定；单糖总量及单糖、双糖总量随蒸晒次数增加总体呈升高趋势，从生品到五蒸五晒品更明显，之后逐渐下降。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

图2 生品、炮制品TLC 色谱图Fig.2 TLC chromatogram of raw product and processing products

表3 糖类含有量测定结果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of saccharides（%， n＝3）

图3 生品（A）、炮制品（B） 糖类含有量变化Fig.3 Content changes of saccharides in raw product（A） and processing products （B）

3 讨论

3.1 检测器选择 曾林燕等［13］采用HPLC-ELSD法，对黄精炮制前后小分子糖的种类和含有量进行了研究。但ELSD 因其结构的特点，在耐用性和稳定性上存在不足；CAD 属于通用性检测器，其灵敏度、稳定性、耐用性均较良好，检测限较低，动态监测范围较宽。糖类化合物具有强极性且无紫外吸收，故本研究选择CAD 为检测器，并选用耐用性较好的聚合物氨基色谱柱对黄精中的单糖、双糖进行分离测定。

3.2 结果分析 通过TLC 法初步判断，黄精经九蒸九晒后单糖含有量升高，低聚糖含有量降低。再进一步建立HPLC -CAD 法来监测炮制过程中单糖（果糖、葡萄糖）、双糖 （蔗糖） 含有量的动态变化。

结果显示，双糖含有量先下降后趋于稳定，单糖、双糖总量先增后减，可能是炮制初期多糖会大量水解成低聚糖、单糖，而低聚糖会进一步水解成单糖；但随着炮制时间延长，果糖、葡萄糖会与氨基酸发生Maillard 反应，导致其含有量也下降［14］。

3.3 合理性分析 九蒸九晒是一种历史悠久的炮制珍贵滋补中药的传统方法，但目前我国对其研究较少，黄精为“四大九蒸货”之一［15］，经反复蒸晒增强了补养滋肾的作用，可能是由于多糖在炮制过程中大量水解成低聚糖和单糖，有利于成分煎出及药效充分发挥，从而增强其补益作用［16-17］。黄精经过五蒸五晒后已达到传统外观质量要求，也符合《中国药典》 性状；多糖趋于稳定，说明具有刺激性的黏多糖已经被破坏降解［18］，同时单糖、双糖含有量达到峰值后有下降趋势，说明炮制后期羰基化合物与氨基化合物发生Maillard 反应，造成单糖损失。

4 结论

本研究建立的HPLC-CAD 法可在30 min 内完成对黄精生品及九蒸九晒品中果糖、葡萄糖、蔗糖含有量的同时测定，可为相关质量控制提供依据。并从外观、性味、糖类成分变化及其之间的关系角度研究，表明五蒸五晒有望作为九蒸九晒的改良，但该方法所得炮制品与黄精生品、九蒸九晒品在药效、临床作用方面是否存在差异尚不明确，还需要结合药效学实验进行更深入的研究。