兔源不动杆菌的分离与鉴定

陈晓蕾 陈 荣 黄瑞玲 李丹琦 屈贵蜀 彭瑶顺 王全溪＊

（1.福建农林大学动物科学学院（蜂学学院） 福州 350002；2.闽南师范大学生命科学学院 福建漳州 363000）

不动杆菌（Acinetobacter spp.）属于变形菌纲，广泛分布于自然界，健康动物的皮肤、胃肠道以及呼吸道中均存在[1]。不动杆菌为机会致病菌，当机体抵抗力低下或长期服用免疫抑制类药物时，容易引起机体感染，可引起败血症、呼吸道感染以及伤口感染等，重症者可导致死亡[2]。

近年来，从流产胎猪[3]、牦牛[4]、梅花鹿[5]、禽[6]和山羊[7]中分离到不动杆菌均有报道与研究，对于兔源不动杆菌报道极少。福建某兔场，患兔表现鼻炎，鼻涕呈黏稠的白色状，精神不振，食欲低下，毛发凌乱，经采集鼻腔黏液分离得到一株不动杆菌，对其敏感药物进行了筛选，研究结果可为兔不动杆菌的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试验动物 LB肉汤培养基、LB营养琼脂购自生工生物工程（上海）股份有限公司；麦康凯琼脂购自广东环凯微生物科技有限公司；伊红美蓝琼脂、革兰氏染液购自北京索莱宝科技有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；细菌生化微量鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司；麦克奥迪BA210生物显微镜。20只6周龄SPF级雄鼠，体重20 25 g，购自福建医科大学实验动物中心；5月龄健康雄兔，体重2 3 kg，购自福建某兔场。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化 无菌采集的患兔鼻黏液接种于LB肉汤培养基中，37℃增菌培养12～24 h后于LB营养琼脂培养基上划线培养，并置于37℃恒温箱中培养24 h。从LB营养琼脂培养基上分离到较为单一的菌落，选取单个菌落，连续传代接种于伊红美兰琼脂培养基。挑取蓝色单个的菌落，革兰氏染色后，镜检观察。使用60%甘油与含有鉴定菌的肉汤培养物1：1混匀保种，备用。同时，取所分离纯化的菌，接种于血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，培养条件同上，观察其生长特性。分离纯化的病原菌编号为FJ01。

1.2.2 生化鉴定 用接种环挑取纯化的菌落接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、西蒙氏枸橼酸盐、硫化氢、尿素酶、半固体琼脂、硝酸盐还原、氧化酶和赖氨酸脱羧酶生化鉴定管中，37℃培养24～48 h后观察结果。

1.2.3 PCR检测以及测序分析 提取细菌16S DNA为模板，设计PCR引物[8]，上游引物：5'-CCTGAATCTTCTGGTAAAAC-3'， 下游 引物 ：5'-GTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC-3'，对分离菌进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，加入PCR MasterMix 12.5 μL，Nuclease-FreeWater 9.5 μL， 上、下游引物各1 μL，模板1 μL。PCR产物送至生工生物工程 （上海）股份有限公司测序，测序结果提交至NCBI的BLAST分析比对，并采用MAGE6.0软件的邻接法构建系统进化树。

1.2.4 药敏试验 采用K-B纸片扩散法[9]对分离菌进行药敏试验。挑取纯化的单个菌落接种于LB肉汤培养基中培养24 h，取适量菌液在LB琼脂培养基上涂板，待菌液稍干后用灭菌的镊子贴药敏片，37℃恒温培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.2.5 动物试验 挑取纯化的单个菌落接种于普通肉汤中培养12 h，采用紫外分光光度法测得菌液浓度为1.08×109cfu/mL。将小鼠分为试验组和对照组，每组各5只。试验组小鼠腹腔注射菌液0.5 mL，对照组注射灭菌生理盐水0.5 mL，观察12 h。同时，使用雾化喷鼻的方式接种菌液2 mL于健康兔鼻腔，观察14 d。

2 结 果

2.1 细菌的培养特性和镜检结果 病原菌增菌后接种在LB肉汤琼脂培养基上置于37℃恒温培养箱中培养24 h，菌落圆形，边缘整齐，光滑，湿润，灰白色。挑取典型菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜的油镜下观察，该菌为革兰氏阴性菌，形态为球杆状，呈双排列（见图1）。该菌在伊红美兰琼脂培养基上长出蓝色带金属光泽菌落；在血琼脂培养基上呈灰白色，未出现溶血情况；在麦康凯琼脂培养基上长出灰白色菌落。

2.2 生化试验结果 该菌发酵葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气，结果见表1。可见分离菌的生化试验结果与不动杆菌基本一致。

表1 分离菌的生化试验结果

2.3 PCR检测以及测序分析结果 PCR检测结果表明，目的基因片段大小为425 bp，由图2可知，目的条带位置与预期结果一致。将获得的基因序列进行测序并比对，结果显示该分离菌为不动杆菌。该分离菌与不动杆菌属同一分支，同源性达97.3%；与鲍曼不动杆菌亲缘性较近，同源性为95.5%；与约氏不动杆菌、溶血不动杆菌、醋酸钙不动杆菌、洛菲不动杆菌等亲缘性较远（见图3）。

2.4 药敏试验结果 由表2可知，该分离菌对青霉素类、头孢呋辛、复达欣、苯唑西林等抗生素耐药，对四环素、哌拉西林、美满霉素和庆大霉素等抗生素敏感性较强，对其他抗生素处于中度敏感或敏感。

2.5 动物试验结果 以浓度为1.08×109cfu/mL的纯化菌液腹腔注射试验组小鼠，6 h内小鼠出现精神抑郁、被毛凌乱、饮食减少、呼吸急促、腹部抖动等情况，12 h内5只小白鼠均死亡。剖检死亡小鼠，可见十二指肠肠壁变薄，胀气，肝脏呈暗红色。空白对照组小鼠无上述症状。无菌采集试验组小鼠的心血，接种于LB肉汤培养基中，37℃恒温培养12 h，对其进行鉴定，证实为不动杆菌，结果表明分离菌为致病性菌，并有较强的致病性。使用雾化喷鼻的方式将菌液接种于兔鼻腔内，7 d后兔出现轻微症状，打喷嚏，流鼻涕，毛发凌乱，采集鼻腔黏液分离得到并鉴定为不动杆菌，结果表明不动杆菌是导致兔患病的病原菌，可以使兔患鼻炎。

3 讨 论

不动杆菌存在于自然界中，是一种机会致病菌，在动物机体免疫力低下时易感染。目前国内外报道，该菌可引起猪肺炎[10]、乌龟腹甲和背甲溃烂[11]、雏鸡死亡[12]和泥鳅皮肤黏液脱落[13]等。本研究从患兔的鼻腔黏液中得到分离菌，并结合培养特征、形态特征、生化试验和特异性基因检测，最终确定分离菌为不动杆菌。

该菌具有复杂的耐药机制，对多数抗生素呈现天然耐药性，并且对很多敏感的药物可迅速产生一定的耐药性[14]。药敏试验结果表明，该菌对头孢呋辛、青霉素类、复达欣、苯唑西林、麦迪霉素和复方新诺明等抗生素耐药，呈耐药趋势。不动杆菌具有获得性耐药能力，临床治疗时应该注意抗生素的选择，避免耐药性的产生。蔡香菊等[15]、赵娜等[16]和李凯旋等[17]研究表明，五倍子、黄芩和黄连等中药对不动杆菌有较好的抑菌效果，我国的中药资源丰富，且中药抗菌谱广、副作用小，近年来使用中药抑制不动杆菌的研究不断增多，中药或许将成为预防和治疗不动杆菌的重要途径。

表2 分离菌的药敏试验结果