云南省蓝舌病病毒“历史毒株”的遗传特征

（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

蓝舌病（bluetongue，BT）是一种由蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）感染引起的烈性出血性动物疫病。BTV 主要通过库蠓属（Culicoidesspp.）雌性昆虫的吸血叮咬传播，能够感染牛、羊、骆驼和鹿等多种家养及野生反刍动物[1]。BTV感染绵羊后可引起较高的发病率和病死率[2-4]。而牛和山羊感染BTV 后往往无明显的临床症状，在BTV 传播过程中扮演了病毒储存库角色[3-4]。据统计，BT 对全球畜牧业生产每年造成约30 亿美元的经济损失，因此被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病[5-6]。

BTV 属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus），其基因组由10 条（genomic segment 1～10，Seg-1～10） 双 链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）片段组成，可编码7 种结构蛋白（VP1～7）和5 种非结构蛋白（NS1～4 以及NS3a）[7]。Seg-2/VP2 是BTV 变异程度最高的成分。VP2 能够诱导被感染动物产生特异性中和抗体，对病毒血清型（serotype）具有决定性作用[7-8]。2008年至今，世界范围新发现了4 种BTV 新血清型（BTV-25～28）。因此，BTV 血清型由过去的24 种增加至28 种（BTV-1～28）[9-12]。

虽然VP3 序列在BTV 毒株间高度保守，但编码该蛋白的Seg-3 序列随BTV 毒株流行地域不同而出现差异，因此可以根据其序列差异，将世界范围内BTV 毒株划分为东方（Eastern）和西方（Western）两种主要的地域型（topotype）[13-14]。与VP3 类似，VP7 和NS3 蛋白的保守程度也较高，其编码节段Seg-7 和Seg-10 的序列变异也与BTV毒株流行地域密切相关，可根据Seg-7 和Seg-10的序列差异，将世界范围内BTV 毒株分为东方和西方两种主要的地域型以及数种地域亚型[13]。Seg-3、-7 和-10 序列具有强烈的地域特征，因此进行上述基因组节段序列分析，能够为追溯病毒起源提供依据[13-15]。

我国1979 年首次在云南省师宗县绵羊中记录了BT 的暴发[16]。之后，湖北省、安徽省、四川省和山西省相继暴发BT，并陆续分离到BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15 和-16 型毒株，其中BTV-1和BTV-16 型在我国流行广泛，并且都能够导致绵羊出现较明显的临床症状[17-19]。2012 年以来，在国家公益性行业（农业）专项资助下，云南省畜牧兽医科学院在云南省、广西壮族自治区、广东省、湖北省、江苏省、山西省、新疆维吾尔自治区和内蒙古自治区等8 个省份设立哨兵动物，共分离到12 种血清型BTV 毒株（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21 和-24）[20-23]。

多种血清型BTV 在我国广泛流行，不同血清型毒株间缺乏交叉保护，病毒通过突变和基因重配，不断产生变异毒株[17，20，22]，这些都为当前的BT 防治工作带来了挑战。对我国不同历史时期的BTV 流行毒株进行序列比较分析，有助于掌握BTV 的演化特征以及我国 BTV 流行毒株的溯源分析。虽然本实验室已经完成了2012 年以来我国不同血清型BTV 分离毒株的全基因组测序，但对1995—1997 年云南省BTV 流行毒株的遗传特征尚不清楚。因此，对1995—1997 年分离自云南省分属7 种血清型的25 株BTV 毒株的Seg-2、-3、-7 和-10基因节段进行了扩增、测序和遗传特征分析，以期为我国BTV 的演化分析与溯源研究提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和minimum Eagle's medium（MEM） 培养基，购自Thermo Scientific 公司；一步法RT-PCR 试剂盒HiScript ⅡOne Step RT-PCR Kit（Dye Plus），购自南京诺唯赞生物科技有限公司；病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒和Universal DNA 胶回收纯化试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 细胞、毒株和病毒培养

幼仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cells，BHK-21），由本实验保存；25 株BTV 毒株，1995—1997 年分离自云南省师宗、芒市、景洪、峨山等地设立的哨兵牛，病毒分离信息见表1。将分离的BTV 毒株接种BHK-21 细胞，当细胞病变（cytopathic effect，CPE）达到90%时刮下细胞，4 ℃ 8 000 r/min 离心15 min，弃去沉淀，将病毒液分装，-80 ℃保存备用。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank 中公布的BTV 毒株序列，采用Oligo 7.0 软件设计10 对引物，分别用于扩增7 种BTV 血清型毒株的Seg-2、-3、-7 和-10（表2）。引物委托上海捷瑞公司合成，以聚碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理水稀释至终浓度为10 μmol/L 备用。

表1 1995—1997 年云南省BTV 分离毒株信息

1.4 RT-PCR 扩增与测序

采用病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒抽提病毒核酸，将核酸于94 ℃变性3 min 后，立即冰浴。分别取5 μL变性核酸为模板，使用表2中的引物对，采用一步法RT-PCR，对BTV 分离毒株的Seg-2、-3、-7 和-10 进行扩增。反应体系如下：2×One Step Mix（Dye Plus）25 μL，One Step Enzyme Mix 2.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，核酸模板5 μL，以无RNA酶水补足至50 μL。反应条件如下：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35 个循环。利用Universal DNA 胶回收纯化试剂盒，对PCR 产物进行电泳胶回收，以PCR 扩增的上、下游引物作为测序引物，对纯化的DNA 进行双向测序。

1.5 序列分析与系统发生树构建

使用DNAstar 软件（Ver 6.0），对测序结果进行序列拼接组装；利用MEGA 6.0 软件[24]，进行序列比对分析。采用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发生树：Seg-2 序列选择“GTR+G”模型，Seg-3 序列选择“TN93+G+I”模型，Seg-7 序列选择“GTR+G+I”模型，Seg-10序列选择“T92+G”模型，自举检验（bootstrap）取值1 000。序列相似度，以平均数（mean）表示。本研究中获取的序列以黑色菱形符号表示。系统发生树中其他国家分离的BTV 毒株序列以“GenBank序列号_BTV 血清型_分离国家_病毒分离时间”表示。

2 结果与分析

2.1 Seg-2、-3、-7 和-10 的RT-PCR 扩增

表2 云南省BTV 分离毒株Seg-2、-3、-7 和-10 的RT-PCR 扩增引物信息

设计10 对引物（表2），对分离的25 株BTV 毒株Seg-2、-3、-7 和-10 进行一步法RTPCR 扩增。结果显示，7 对针对不同血清型Seg-2的引物均能够特异性地扩增出大小约为1 200 bp，与预期大小相符的DNA 片段，而针对Seg-3、-7和-10 的3 对引物，也能够特异性扩增出大小分别为1 100、1 100 和800 bp，与预期大小相符的目的DNA 片段。

2.2 Seg-2 序列分析

序列比对分析显示，云南省1995—1997 年分离的25 株BTV 毒株分属BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15 和-16 型等7 种血清型。世界范围内27种血清型（BTV-1～27）BTV 毒株的Seg-2 可分为12 种基因型（Nucleotype A—L）[13，15]。在系统发生树上，本研究中的25 株BTV Seg-2 与对应血清型BTV 参考毒株聚为一簇，分属A、B、H、I、G 和J等6 种基因型，与对应血清型BTV 国际标准参考毒株的Seg-2 序列相似度大于68.10%，VP2 序列相似度大于75.00%（图1～2），表明早期通过血清中和试验对BTV 血清型鉴定结果的正确性。云南省分离的同一种血清型BTV 的Seg-2/VP2 序列高度相似，Seg-2 核苷酸序列相似度在92.80%～100%之间，VP2 氨基酸序列相似度在96.90%～100%之间（图2），表明云南省流行的同一血清型BTV 的Seg-2 有着最近的共有祖先。

研究发现，同种血清型BTV 毒株Seg-2 之间，其序列也存在较大差异，并可根据这种差异，将同一血清型BTV 的Seg-2 分为东方地域型（Eastern topotype） 和西方地域型（Western topotype）[13，15]。构建的系统发生树显示，云南省分离的2 株BTV-12 型毒株（B139 和B334）的Seg-2 与南非BTV-12 型毒株聚为一簇，序列相似度大于98.10%，属于Western 地域型。云南省分离的BTV-1、-2、-3、-4、-15 和-16 型等毒株的Seg-2 与分离自日本、印度和澳大利亚的同血清型毒株聚为Eastern 地域型，其Seg-2 序列相似度在89.03%～95.46%之间，VP2 序列相似度在90.92%～98.30%之间；与同血清型Western 地域型毒株的Seg-2 序列相似度在68.00%～95.81%之间，VP2 序列相似度在75.28%～97.14%之间（图1～2）。

2.3 Seg-3 序列分析

Seg-3 序列比对分析显示，本研究的25株BTV 毒株间Seg-3 核苷酸序列相似度在79.35%～93.93%之间，VP3 氨基酸序列相似度在96.83%～99.95% 之间（图2）。构建的Seg-3 系统发生树显示，云南省分离的25 株BTV 毒株与来自中国台湾、澳大利亚和印度等地的毒株一同构成Eastern 地域型（图3）。本研究中的25 株BTV 与国外分离的Eastern 地域型、Western 地域型和新血清型（BTV-25～28）毒株间Seg-3 序列相似度在74.63%～89.29%之间，VP3 序列相似度在88.69%～99.12%之间（图2）。在Eastern地域型内部，4 株云南省分离的BTV-15 型毒株与1 株澳大利亚的BTV-15 型毒株聚为相对独立的一簇，构成远东地域亚型（Far Eastern topotype）（图3）[15]，与Eastern 地域型其他毒株以及Western 地域型、新血清型（BTV-25～28）毒株间的Seg-3/VP3 序列相似度在75.18%～79.60%/88.20%～96.83%之间（图2）。这一方面表明云南省与澳大利亚的BTV-15 型毒株Seg-3 有着共同的起源，另一方面也表明该基因节段在进化上的相对独立性。

2.4 Seg-7 序列分析

图1 1995—1997 年云南省BTV 分离毒株Seg-2 系统发生树

云南省不同血清型BTV 毒株间Seg-7 核苷酸序列相似度在73.85%～94.36%之间，VP7 氨基酸序列相似度在85.96%～99.35%之间（图2）。Maan等[13]的研究显示，BTV 的Seg-7 可分为3 种东方地域亚型（Eastern topotype 1～3）和7 种西方地域亚型（Western topotype 1～7）。云南省分离的21 株BTV 毒株的Seg-7 分属Eastern topotype 1～3地域亚型，分别与来自中国台湾、日本、印度和澳大利亚等地毒株的Seg-7 享有最近的亲缘关系（图4）。值得注意的是，云南省4 株BTV 的Seg-7 属于Western 地域型：云南省BTV-2 型毒株（B238）和BTV-12 型毒株（B139 和B334） 的Seg-7 属于Western topotype 1 地域亚型，与南非毒株具有最近的亲缘关系[13]，序列相似度大于98.60%；BTV-16 型（B034）毒株为Western topotype 3 地域亚型，与荷兰毒株（GQ506478）和南非毒株（GQ506512）具有最近的亲缘关系，序列相似度均为95.60%（图4）。上述4 株BTV 毒株的Seg-7 序列相似度在78.90%～100%之间，VP7 序列相似度在94.60%～100%之间，而与云南省分离的Eastern 地域型毒株的Seg-7/VP7 序列相似度分别在78.33%～79.07%/94.46%～95.74%之间（图2）。

2.5 Seg-10 序列分析

云南省分离的25 株BTV 毒株的Seg-10 核苷酸序列相似度在86.61%～94.68%之间，NS3 氨基酸序列相似度在95.00%～99.08%之间（图2）。BTV 毒株Seg-10 系统发生树显示，该基因节段序列被划分为2 个东方地域亚型（Eastern topotype 1～2） 和3 个西方地域亚型（Western topotype 1～3）（图5）[13]。云南省分离的22 株BTV 毒株的Seg-10 均属于Eastern topotype 1 地域亚型，分别与来自中国台湾、日本、印度和澳大利亚等地毒株的Seg-10 享有最近的亲缘关系（图5）。而3 株云南省分离的BTV-15 型毒株（B105、B358和B359）单独构成Eastern topotype 2 地域亚型，与其他地域亚型毒株间Seg-10/NS3 序列相似度则在76.93%～85.81%/83.41%～97.26% 之间（图2、图5）。本研究中的25 株BTV 与Eastern topotype 1 地域亚型内其他毒株、Eastern topotype 2 地域亚型和Western 地域型亚型毒株间的Seg-10 序列相似度在77.02%～91.37%之间，NS3 序列相似度在83.23%～97.55%之间（图2、图5）。

图2 1995—1997 年云南省BTV 分离毒株核苷酸/氨基酸序列相似度

3 讨论

云南省复杂的地理环境和气候条件造就了该地区动物、植物和病毒的天然多样性。云南省地处我国边境地区，与越南、老挝和缅甸等多国接壤，家畜及畜产品贸易频繁，动物疫病跨境传播风险较高。多种血清型BTV 在云南省广泛流行，说明该地区在我国BT 防控中具有举足轻重的地位。过去认为BTV 主要流行于南纬35°至北纬40°之间。但是，随着气候变暖、库蠓活动范围扩大和潜在传播虫媒种类增多，BT 有逐渐向寒冷的高海拔和高纬度地区扩散的趋势[2，25-27]，对我国北方地区的牛羊养殖业构成了威胁。掌握云南省1995—1997 年BTV 流行毒株的遗传背景，能够为分析我国BTV演化特征，进行病毒扩散与溯源分析提供宝贵的序列信息。

图3 1995—1997 年云南省BTV 分离毒株Seg-3 系统发生树

图4 1995—1997 年云南省BTV 分离毒株Seg-7 系统发生树

图5 1995—1997 年云南省BTV 分离毒株Seg-10 系统发生树

1995—1997 年，本实验室在云南省分离出7种血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15 和-16），2012 年至今，在云南省哨兵动物中分离出11 种血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-9、-12、-15、-16、-21 和-24）[17-23]，表明云南省流行的BTV 血清型具有多样性。BTV-5、-9、-21 和-24等4 种血清型BTV 在云南省的首次发现，提示我国可能还有其他血清型BTV 存在，因此对我国流行BTV 多样性的监测仍是一个长期的过程。病毒所处的生态环境不同，施加的选择压力不同，病毒的基因进化就会呈现出特定的地域特征。本研究发现，云南省流行的BTV 毒株序列也呈现出特有的地域特征：云南省流行的BTV-15 型毒株的Seg-3 形成了独立于Eastern 地域型和Western 地域型的进化分支（Far Eastern topotype），BTV-1和BTV-16 型毒株的Seg-2 也形成了独立的进化支系，BTV-15 型毒株的Seg-10 形成独立的Eastern topotype 2 地域亚型，揭示了云南省流行的BTV 在进化上的独特性。

Western 地域型BTV 毒株侵入云南省后，在传播过程中与我国本地流行毒株发生了基因重配，与同属环状病毒属的流行性出血病病毒（epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV）某些血清型间Seg-7 较难发生重配不同[28-29]，BTV 毒株的Seg-7片段能够在自然环境中发生相对自由的重配，提示BTV 进化可能主要由基因重配驱动，使病毒更适合在当地的生态系统中传播和生存[20]。

本研究通过分析1995—1997 年分离自云南省分属7 种血清型的25 株BTV 毒株Seg-2、-3、-7和-10 的遗传特征，发现云南省存在多种血清型BTV 流行，既有本地长期流行的BTV-1 型和BTV-16 型毒株，也有Western 地域型BTV 毒株侵入云南省后发生重配的毒株，提示我国BT 防控形势十分严峻。本研究为分析我国BTV 毒株的突变和基因重配提供了第一手资料，为追溯我国BTV 毒株来源提供了依据。