神经外科术后患者手术部位感染肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌分子流行病学研究*

黄泽玉，郑光辉，吕 虹，康熙雄，张国军△

(1.首都医科大学附属北京天坛医院检验科，北京 100070;2.北京市免疫诊断临床 工程技术研究中心，北京 100070)

神经外科术后患者手术部位感染是目前困扰临床的一类重要感染，严重影响患者手术的成功率和病死率[1]。有文献报道，神经外科手术发生术后感染患者的病死率比未发生感染患者提高30%[2]。近年来，随着临床上抗菌药物的大量使用，抗菌药物耐药成为一项严重的社会问题。由耐药菌导致的中枢神经系统感染危害更为严重，尤其是肺炎克雷伯菌[3]、鲍曼不动杆菌[4]等革兰阴性菌，由于其易出现诱导耐药且毒性高，对临床危害更大。本研究对2014-2019年首都医科大学附属北京天坛医院神经外科术后感染患者脑脊液中分离的鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌进行表观及分子流行病学分析，探究其临床分离率和耐药性变化及耐药基因的分布，为控制神经外科术后患者感染多重耐药肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 对2014-2019年首都医科大学附属北京天坛医院神经外科术后感染患者脑脊液中分离的肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌进行回顾性分析。本研究执行文献[5]报道的神经外科术后感染标准：(1)脑脊液细菌培养为肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌的患者；(2)脑脊液白细胞计数>250×106/L。同时符合以上2项标准的患者确诊为脑膜炎。

1.2药敏试验方法 脑脊液标本采用全自动仪器进行培养、鉴定和药敏试验，培养系统为Bectec 9240、Bac/alert 800；鉴定药敏系统包括Phoenix 100、VITEK-2 Compact及VITEK MS等；药敏试验采用微量肉汤稀释法；结果判断依据美国临床和实验室标准化协会2018年标准[6]。

1.3耐药基因选择与检测 参照文献[6]选择30项耐药基因，采用基于环介导等温扩增技术(LAMP)建立的恒温微流控芯片方法对多重耐药菌进行基因检测，具体基因参数如下：Ompk35、blaSHV、blaVIM、blaIMP-3、blaKPC、blaTEM、blaIMP-4、blaOXA-1、blaCTX-M-9、blaOXA-66、blaOXA-23、blaCTX-M-1、arr-2、aadA1、CYM-2等，检测流程图与示意图见图1。

图1 恒温微流控芯片方法检测流程图与示意图

1.4统计学处理 采用细菌流行病学监测软件WHONET5.5和IBMSPSS20.0软件进行数据分析；计数资料以例数或百分率表示。

2 结 果

2.1神经外科术后患者手术部位感染肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌分布情况 2014-2019年首都医科大学附属北京天坛医院神经外科术后共送检脑脊液标本53 556份，共分离出细菌4 231株，分离率为7.9%，共分属于2 154例患者，其中革兰阴性菌885株，分属于399例患者，构成比为18.5%(399/2 154)。鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌是最主要的细菌，其中鲍曼不动杆菌共102株，占所有革兰阴性菌感染者的25.6%，肺炎克雷伯菌84株，占所有革兰阴性菌感染者的21.1%，其次为大肠埃希菌35株，构成比为8.8%，铜绿假单胞菌17株，构成比为4.3%，各年度分离菌株数与构成比见表1。

表1 2014-2019年神经外科术后患者手术部位感染革兰阴性菌的分离数与构成比分布情况[n(%)]

2.2鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的耐药性变迁分析 鲍曼不动杆菌对17种抗菌药物的敏感率见表2。6年间鲍曼不动杆菌的耐药性逐年上升，其对氨曲南的敏感率在2018-2019年仅为4.9%，整体敏感率为10.3%。美罗培南的敏感率逐年下降，2018-2019年的敏感率降至34.3%，整体敏感率为48.8%。多黏菌素B为最有效的抗鲍曼不动杆菌感染药物，敏感率为100.0%。除多黏菌素B外，敏感率最高的抗菌药物为复方磺胺甲噁唑，整体敏感率为55.8%。肺炎克雷伯菌对18种抗菌药物的敏感率见表3，相对于鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯菌的敏感率较高，虽然也出现了逐年下降的趋势，但其对于氨曲南的敏感率仍为46.9%，对美罗培南的敏感率从2014-2015年的83.9%降至2018-2019年的56.2%，多黏菌素B仍然为抗多重耐药肺炎克雷伯菌最有效的药物，敏感率为100.0%，除多黏菌素B外，敏感率最高的抗菌药物为复方磺胺甲噁唑，整体敏感率为75.5%。

表2 鲍曼不动杆菌对17种抗菌药物的敏感率比较(%)

表3 肺炎克雷伯菌对18种抗菌药物的敏感率比较(%)

续表3 肺炎克雷伯菌对18种抗菌药物的敏感率比较(%)

2.3神经外科术后感染多重耐药鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的耐药基因构成分布 2014-2019年首都医科大学附属北京天坛医院神经外科病区术后患者手术部位感染多重耐药的23株肺炎克雷伯菌和35株鲍曼不动杆菌的耐药基因测试结果见表4、图2。35株鲍曼不动杆菌构成比最高的基因型为blaOXA-66[24株(68.6%)]、blaTEM[24株(68.6%)]，blaOXA-23也占了较高的比例[23株(65.7%)]，Ompk35和blaSHV构成相对较低，为40.0%与42.9%。23株多重耐药肺炎克雷伯菌中，22株(95.7%)由于同时具有Ompk35和blaSHV基因而表现为对碳青霉烯类抗菌药物耐药，而产碳青霉烯酶最常见的基因型为blaKPC[19株(82.6%)]，其他类型的碳青霉烯酶相关基因分布较少。

表4 神经外科术后手术部位感染多重耐药鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的耐药基因构成分布[n(%)]

注:A为多重耐药鲍曼不动杆菌；B为多重耐药肺炎克雷伯菌。

3 讨 论

神经外科术后细菌性感染是目前临床上一类重要的感染，由于神经外科手术的复杂性及患者免疫力相对下降，导致其严重影响患者手术的成功率和存活率。本研究结果显示，神经外科术后感染革兰阴性菌的构成比为18.5%(399/2 154)。由于分离出的革兰阳性菌含有大量如凝固酶阴性葡萄球菌的污染菌，导致感染革兰阴性菌的比例远远高于18.5%[7]。除此之外，由于革兰阴性菌的耐药性泛滥及侵袭力逐年上升，分析其在神经系统感染方面的流行病学特征有重要临床意义。鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌是造成神经外科术后细菌性感染构成比最高的革兰阴性菌，分别占25.6%、21.1%，故本研究对这两种致病菌进行了表观及分子流行病学分析，对其耐药性变迁及耐药基因的分布进行了分析与检测。

泛耐药革兰阴性杆菌是目前导致临床上抗菌药物滥用危机的最主要细菌，2017年2月世界卫生组织公布了12类危险程度最高的耐药菌名单，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌与碳青霉烯耐药肠杆菌分列第1位和第3位[8]，均属于临床具有极高迫切度的致病菌。鲍曼不动杆菌为神经外科术后分离率最高的革兰阴性菌，其获得性耐药率较高。本研究结果显示，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的比例较高，达48.8%，且仍存在下降趋势，2018-2019年其对于美罗培南的敏感率仅为34.3%，对临床造成极大的威胁。目前，仅多黏菌素B对肺炎克雷伯菌的敏感率达到100.0%，但由于多黏菌素B的低蛋白结合率及高毒性，使其在中枢神经系统感染方面的应用受限。肺炎克雷伯菌是分离率第2的革兰阴性菌，相对于鲍曼不动杆菌，其毒性与侵袭性更强，感染患者的病死率也高于鲍曼不动杆菌。与鲍曼不动杆菌类似，对肺炎克雷伯菌最有效的抗菌药物同样为多黏菌素B，由于多黏菌素的自身因素，导致其在抗中枢神经系统肺炎克雷伯菌感染方面的应用受限。

本研究结果显示，2014-2019年鲍曼不动杆菌对绝大多数抗菌药物的耐药性出现急剧上升，原因可能是抗菌药物滥用而导致诱导耐药。由于革兰阴性菌的大量耐药基因处于可移动的质粒中，而质粒在各种耐药菌之间的转导会导致耐药基因的水平扩散，造成耐药菌传播[9]，故对致病菌的耐药基因研究可以有效针对耐药元件的扩散进行控制，进而遏制耐药菌产生。本研究结果显示，鲍曼不动杆菌的耐药基因型主要为D类的blaOXA系列，与文献[10-11]报道类似。泛耐药鲍曼不动杆菌的分子流行病学研究显示，其耐药基因型主要为blaOXA-23与blaTEM，本研究2项基因型占比分别为65.7%与68.6%,这两类基因均表达在质粒上，故其存在横向基因迁移的基础，若能对耐药基因的横向传播进行阻断，则可以很好地抑制耐药元件的传播。碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌的耐药机制不完全一致，肺炎克雷伯菌的耐药基因型主要为A类的blaKPC。有文献报道，亚太地区碳青霉烯耐药肠杆菌的主要流行株为blaKPC、blaNDM及blaVIM[12-13]，其中blaNDM主要为印度及巴基斯坦流行株[12]。本研究并未出现blaVIM流行株，原因可能为单中心研究。膜孔蛋白Ompk35在肺炎克雷伯菌中表达较高。有文献报道，膜孔蛋白缺失的革兰阴性菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药性会大幅度上升，故有感染膜孔蛋白缺失的肺炎克雷伯菌时应注意[13]。

4 结 论

综上所示，鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌是导致神经外科术后手术部位感染的重要细菌，尤其是多重耐药菌感染更是一项社会问题。如何控制耐药菌及耐药基因的传播是今后工作的重点，尤其是对于易诱导耐药的鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌，控制其可能存在的基因横向迁移，是解决耐药菌传播的重要方案。