1,25(OH)2D3联合顺铂对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响

尹端端 王真真 周文文 王小玉 赵子舒 杨雁鸿

【摘要】目的：探讨1，25二羟基维生素D3（1，25（OH）2D3）联合顺铂（DDP）在体外对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响及可能存在的机制。方法：体外培养宫颈癌Hela细胞，MTT法检测1，25（OH）2D3和DDP对Hela细胞增殖的影响。流式细胞术分析细胞周期。Western blot检测1，25（OH）2D3和DDP对Hela细胞内P27蛋白表达水平的影响。结果：所选浓度范围内（10-8～10-6mol/L）的1，25（OH）2D3对Hela细胞的增殖抑制差异无统计学意义（P>0.05），但与作用时间密切相关（P<0.05），DDP浓度在5-20μg/ml范围内对Hela细胞增殖有明显的抑制作用，并呈浓度及时间依赖性（P<0.01）。流式细胞仪检测到1，25（OH）2D3处理12h后联合DDP组G0/G1期（DNA合成期）细胞比例明显增多（P<0.01）。Western blot观察到1，25（OH）2D3处理12h后联合DDP组细胞内P27蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。结论：1，25（OH）2D3可能通过上调Hela细胞内P27蛋白表达水平，与顺铂协同促进细胞凋亡、诱导细胞周期阻滞，进而提高顺铂抗肿瘤作用。

【关键词】1，25二羟基维生素D3;宫颈癌Hela细胞;细胞凋亡

【中图分类号】

R851.7【文献标识码】A

【文章编号】2095-6851（2020）08-128-01

维生素D是机体正常运转不可或缺的重要物质，是脂溶性维生素的一员，属固醇类衍生物。维生素D的重要生物学作用除了调节体内钙磷代谢、保持骨骼强壮外，还能够直接和间接的参与到机体的免疫调节。自从20世纪80年代人们发现，1，25（OH）2D3在人白血病细胞中的抗增殖效应以来，就逐渐确定了它对肿瘤治疗的潜力。本实验将1，25（OH）2D3联合DDP作用于宫颈癌Hela细胞，详见下文报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 宫颈癌Hela细胞株由秦皇岛市第一医院中心实验室赠送。

1.1.2 药物 顺铂冻干粉剂 （DDP） （山东齐鲁制药厂生产） ，1，25二羟维生素D3 （1，25（OH）2D3） （Sigma公司产品）。

1.1.3 主要试剂 四甲基氮唑蓝（MTT）（Sigma公司产品）、胰蛋白酶（北京博奥森产品），P27一抗（沈阳万类生物），二抗（HRP标记羊抗兔）（沈阳万类生物），DNA小分子量marker（MBI产品），二甲基亚砜（DMSO） （Amresco产品），DMEM高糖培养基（Corning产品），胎牛血清（ 四季青产品），Annexin V/PI试剂盒（联科生物公司）。

1.1.4 主要仪器 CO2電热恒温培养箱（日本SANYO公司），倒置显微镜（日本OLYMPUS），酶标仪（上海科华公司），流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司生产），图像扫描系统（6661-9μm，明基电通信息技术有限公司），凝胶自动成像仪（Image Master VDS型，Pharmacia公司，瑞典），半干转膜仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 宫颈癌Hela细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，在5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱中，2-3天用0.25%胰蛋白酶消化传代一次。

1.2.2 噻唑蓝比色法（MTT）计算细胞抑制率 取对数生长期Hela细胞以2×105个/孔接种于96孔板。对照组（等容积培养基）、1，25（OH）2D3设5个浓度组：分别为10-8mol/L、5×10-8mol/L、10-7mol/L、5×10-7mol/L、10-6mol/L，DDP设4个浓度组，分别为5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml，1，25（OH）2D3（终浓度为10-6mol/L）联合DDP（终浓度为10μg/ml）组及1，25（OH）2D3（终浓度为10-6mol/L）预处理+DDP（终浓度为10μg/ml）组，分别作用于Hela细胞24、48、72h后，各孔加入5mg/ml MTT 20μl，继续置于37℃ 5% CO2培养箱中培养4h，后各孔加入标准浓度的二甲基亚砜（DMSO）200μl，震荡混匀15min，490nm波长酶标仪检测吸光值（OD）。计算24、48、72h各药物不同处理条件下对Hela细胞的抑制率。公式： 抑制率=（对照组平均吸光值-实验组平均吸光值）/对照组平均吸光值×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期的Hela细胞，以1×106个/孔接种于6孔板中，置37℃、5% CO2培养箱内培养。E组空白对照组（等容积DMEM高糖培养基） 、A组1，25（OH）2D3组（终浓度为10-6mol/L）、B组DDP组（终浓度为10μg/ml）、C组1，25（OH）2D3联合DDP组及D组1，25（OH）2D3预处理+DDP组。置37℃、5% CO2培养箱内继续培养48h。后制备单细胞悬液、固定、染色后流式细胞仪测定，计算机可自动分析出细胞周期情况。

1.2.4 Western blot技术检测细胞内P27蛋白的表达水平 将Hela细胞以5×105个/孔接种于6孔板，培养24h后分组。空白对照组（等容积DMEM高糖培养基）、A组1，25（OH）2D3组（终浓度为10-6mol/L）、B组DDP组（终浓度为10μg/ml）、C组1，25（OH）2D3联合DDP组及D组1，25（OH）2D3预处理+DDP组。培养48h后每孔加入250μl细胞裂解液（RIPA：PMSF=100：1） 后按以下步骤操作： 提取蛋白、蛋白定量、煮蛋白、配胶、灌胶、电泳、转膜、封闭、加一抗（P27抗体）、加二抗（HRP标记羊抗兔）、显影。且相应蛋白表达值为条带的灰度值除以β-actin内参值校正。

1.3 统计学处理 实验所得数据资料以均数±标准差（x±s）表示，采取SPSS19.0统计学软件对所测得数据进行分析，多因素方差分析用于不同组间的比较，LSD法用于组内两两的比较。P<0.05判定是否有统计学意义。

2 结果

2.1 Hela细胞增殖的抑制作用

1，25（OH）2D3能抑制Hela细胞增殖，并呈时间依赖性。随着作用时间的延长，其对Hela细胞的抑制率逐漸增高。

DDP能抑制Hela细胞增殖，并呈时间及浓度依赖性。随着剂量增加及作用时间的延长，其对Hela细胞的抑制率逐渐增高。

联合1，25（OH）2D3可明显提高DDP对Hela细胞增殖的抑制作用。

2.2 联合应用对Hela细胞的影响

E组体现的为未加药物处理的宫颈癌Hela细胞，B、C、D各组细胞周期中G0/G1期比例均较E组增加（P<0.01）;C、D各组中G0/G1期比例均较B组增加（P<0.01），D组中G0/G1期比例较C组增加（P<0.01）

2.3 联合应用对Hela细胞内P27蛋白的影响

结果显示：A～D各组与E组相比，各组细胞内P27蛋白表达明显增加（P<0.01），C、D组P27蛋白表达较B组有统计学差异（P<0.01），D组相较于C组也有统计学差异（P<0.05）

3 讨论

1，25（OH）2D3就是近年来的研究热点之一。目前了解到的1，25（OH）2D3抗肿瘤作用机理包括引起G0/G1期细胞堆积、上调胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）的表达、抑制肿瘤细胞周围血管的生成等，进而达到减少癌细胞增殖分化、转移及浸润。有研究显示1，25（OH）2D3可作为潜在辅助治疗手段。

本研究提示无论是单药1，25（OH）2D3、DDP还是两药联合应用，都能使宫颈癌HeLa细胞增殖分化被抑制。MTT实验发现，1，25（OH）2D3预处理12h后序贯顺铂组比1，25（OH）2D3联合顺铂同时处理组的细胞增殖抑制作用更显著，由此可见，1，25（OH）2D3能提高DDP对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制效果。本实验流式细胞技术检测显示，单药顺铂能使Hela细胞周期于G0/G1期堆积;单药1，25（OH）2D3作用一定时间后亦可使Hela细胞周期积滞在G0/G1期，进而抑制细胞的增殖分化，其中，1，25（OH）2D3预处理12h后加顺铂组Hela细胞周期中G0-G1期细胞比例增高最显著，可见，1，25（OH）2D3可以提高DDP对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制效果。本实验中Western Blot的研究结果显示：与空白对照组比对，各组Hela细胞内P27蛋白表达均有不同程度的增加。其中1，25（OH）2D3预处理12h后序贯DDP组Hela细胞内P27蛋白表达增多最明显。

以上结果显示，1，25（OH）2D3有提高DDP对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制效果的作用，其抗肿瘤机制尚需进一步研究。

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