云南傣族、彝族、汉族Citrin缺陷SLC25A13基因突变的筛查

2020-08-24 08:25叶峻杰孙丽娟陈婷婷马娅萍杜应雄
中国计划生育学杂志 2020年4期
关键词:希特傣族基因突变

叶峻杰 孙丽娟 陈婷婷 马娅萍 杜应雄 张 乐

1.云南省人口和计划生育科学技术研究所,国家卫生计生委西部孕前优生重点实验室,云南省生育调节与少数民族优生重点实验室(昆明,650021);2.重庆市人口和计划生育科学技术研究院,国家卫生计生委出生缺陷与生殖健康重点实验室

希特林(Citrin)是位于染色体7q21.3的SLC25A13基因编码的线粒体内肝型天冬氨酸/谷氨酸载体(AGC)蛋白,在尿素循环及其他代谢过程中发挥重要作用,编码基因突变将导致希特林蛋白缺陷病[1]。在临床诊疗中希特林缺陷所致新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD)是仅次于甲基丙二酸尿症位居第二位的新生儿遗传性代谢病,其确诊需行编码希特林蛋白的SLC25A13基因突变检测。SLC25A13基因突变携带率在中国分布呈现明显的地域差异,长江以南地区发病率明显高于长江以北地区[2-3]。彝族和傣族分别是云南中北部和南部分布较广的民族,应用Y染色体单倍型分析显示彝族和傣族群体分别属于藏缅语系和壮侗语系分支[4],希特林蛋白基因突变在这两个民族中的分布未见报道。本项目应用等位基因特异性引物扩增方法(AS_PCR),对云南彝族、傣族、汉族(南方汉族)SLC25A13基因突变携带率进行筛查,为NICCD临床早期遗传咨询和明确病因提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

994例傣族样本采自云南省西双版纳傣族自治州,年龄1~80岁,其中男408例、女586例;454例彝族样本采自云南省丽江市宁蒗彝族自治县,年龄1~52岁,其中男126例、女328例;741例汉族样本采自云南省昆明市,年龄1~76岁,其中男340例、女401例。所有样本源于本民族3代以内的个体,且相互无亲缘关系。本项目的研究对象均签署知情同意书,并经本所医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1基因组DNA提取 采集外周血2ml,采用AxyPrep血基因组DNA试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2荧光标记多重PCR扩增反应 选取希特林缺陷病相关的SLC25A13基因10个突变位点(占中国人群已知致病变异的90%以上[5]),采用等位基因特异性引物PCR法(AS-PCR),又称突变阻滞扩增系统(ARMS),荧光标记复合扩增目的片段[6],通过毛细管电泳检测荧光标记的扩增产物,GeneMapper software 5软件用于DNA片段长度分析,基因变异位点不同基因型以片段长度进行区分。10个突变位点的基本信息见表1。多重PCR反应体系为:Master Mix(2×)10μl,Primer Mix 2μl,Q-solution 2μl,模板DNA 1μl,水5μl,总反应体积20μl(上海基康生物技术有限公司);反应条件如下:95℃15min,95℃30s、58℃45s、72℃60s,共28个循环,然后72℃保温60min;扩增产物的片段长度通过毛细管电泳检测分析。

1.2.3 Sanger测序 PCR产物经纯化后用ABI 3500测序仪进行测序。

1.2.4统计学处理 SLC25A13基因突变携带率数据分析采用SPSS17.0统计软件包,进行χ2检验,P<0.05(双侧)表示差异有统计学意义。

表1 SLC25A13基因10个突变位点的基本信息

(接下表)

(接上表)

2 结果

2.1 CT1~8位点基因突变筛查

扩增产物通过毛细管电泳进行分离,基因分型结果以不同长度的扩增产物峰呈现见图1。突变样本进行Sanger测序验证[7]。

图1 SLC25A13基因毛细管电泳片段分析结果

2.2 傣、彝、汉3个民族SLC25A13基因10个位点的突变携带率分析

傣、彝、汉3个民族突变基因携带率分析结果见表2。傣族和彝族3代本民族的群体中均检出CT4(IVS16ins3kb)插入突变和CT8(c.851-854del4)缺失突变;云南汉族群体中除检出上述两个突变位点外,还发现CT2(c.1638_1660dup23)重复突变。傣、彝、汉族SLC25A13基因10个位点的突变携带率分别为1.2%(1/83)、0.44%(1/227)和1.48%(1/67)均无差异(P>0.05)。从3个民族的突变携带率推导出理论上的发病率分别为1/27 445、1/206 116和1/18 151,总的发病率为1/30 667。

表2 SLC25A13基因10个突变位点在3个民族中的分布

3 讨论

希特林缺陷病的致病基因SLC25A13长度约为260 kb,共含18个外显子和17个内含子,其编码的希特林蛋白的分子量为74 000(675个氨基酸),包括N端用于结合钙离子特性的4个EF手结构域和羧基端的6个线粒体跨膜结构[1,8]。SLC25A13基因纯合或复合杂合子突变导致希特林蛋白质合成的终止,从而造成希特林蛋白缺失或合成减少。基因突变类型大多为点突变,其次为重复/缺失突变和剪切突变。目前为止已报道基因变异107种[9]。其中10个SLC25A13基因突变位点(c.851-854del4、IVS6+5G>A、c.1638_1660dup23、IVS16ins3kb、c.1399C>T、c.955C>T、c.1592G>A、c.754G>A、IVS11+1G>A、c.1092_1095del T)与临床表型密切相关,尤其是c.851-854del4(58.41%)、IVS6+5G>A(8.41%)、c.1638-1660dup23(8.85%)和IVS 16ins3kb(7.52%),这4个突变位点在中国人群中占所有突变的80%以上[5,10]。目前SLC25A13基因突变检测大多采用对18个外显子及相邻序列扩增后PCR-RFLP或者直接测序的方法,但对于大片段剪切、缺失突变判别困难,而采用全基因组二代测序方法费用较高。本研究针对上述10个基因突变位点,应用AS-PCR方法,参照Little[6]的方法增加了人为错配碱基以加强引物的特异性,将点突变转变为片段长度多态,10个基因位点经荧光标记引物复合扩增后,运用毛细管电泳分析加强片段的分辨率。实验流程快速经济,结果类似于短串联重复(STR)基因座片段分析,图谱简单直观,易于临床实验室推广[11]。

希特林缺陷病例报道以东亚地区居多。有报道,日本、韩国、中国健康人群SLC25A13基因突变携带率分别为1/69、1/112、1/65[2,12-13]。在中国呈明显的人群地域差异:在长江以北约为1/940,而在长江以南约为1/48[2-3];中国人群发病率(1/17 000),与日本、韩国的发病率相似,进一步估算长江以南的发病率为1/9 200,长江以北的发病率为1/3 500 000[2]。Zhang等[14]小样本流行病学调查显示广东省希特林缺陷病突变基因携带率为1/47(52/2428),发病率为1/8800,患者约11 800人。在本研究中,云南傣、彝、汉族SLC25A13基因的突变携带 率 分 别 为1.2%(1/83)、0.44%(1/227)和1.48%(1/67),总的突变基因携带率为1/88(25/2189),且3个民族突变基因携带率无明显差异,说明希特林缺陷病在云南省广泛存在。3个民族人口均超过百万,其中彝族(藏缅语系)广泛分布于云南省北部和中部地区,傣族(壮侗语系)分布于云南省南部和西南部地区,理论上3个民族的发病率分别为1/27 445、1/206 116和1/18 151,总的发病率为1/30 667,相比广东地区及长江以南地区的发病率低。根据云南省2017年人口总数统计结果,云南省希特林蛋白缺陷病患者约1565人,此结果为临床筛查和干预提供参考[15]。基因突变有较大的种族差异性,c.851_854del4位点在中国长江以南的突变携带率为1/70,远高于中国长江以北、韩国、日本的突变携带率(1/940,1/223,1/343)[3]。应用Y染色体单倍型和D7S1812(位于SLC25A13基因的第15外显子)研究东亚人群迁移的结果显示c.851_854del4突变位点的起源大概在云南和广西地域[4,15]。本研究中3个民族均有c.851_854del4突变位点,该位点在傣族人群中占总突变基因携带例数的75.0%,在云南汉族(南方汉族)人群中占总突变基因携带例数的72.7%,一定程度上显示c.851_854del4突变位点的起源,而傣族和彝族群体中IVS16ins3kb是除c.851_854del4外唯一检测到的突变位点,其占比在少数民族群体中是否较高需要大规模的分子流行病学调查。

希特林蛋白缺陷病的临床表现、影像学和病理学表现等均缺乏特异性,SLC25A13基因突变检测对其确诊具有重大意义。临床上NICCD患儿一旦确诊,饮食方面给予无乳糖并强化中链三酰甘油(MCT)的特殊配方奶粉可迅速改善NICCD患儿病情[16]。本项目通过对云南少数民族SLC25A13基因突变的调查,可以为地区性的新生儿代谢病筛查、遗传咨询及干预治疗提供参考。

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