基于ISSR标记的卡特兰种质资源遗传多样性分析

崔学强，唐 璇，黄昌艳，邓杰玲，李秀玲，张自斌，卢家仕

(广西农业科学院花卉研究所，广西 南宁 530007)

【研究意义】卡特兰又名卡特利亚兰或嘉德利亚兰，是兰科(Orchidaceae)卡特兰属(Cattleya)及其近缘属物种的统称，主要产于中南美洲一带，为巴西、哥伦比亚及哥斯达黎加等国的国花。卡特兰假鳞茎呈纺锤形或圆柱形，叶革质，单叶或双叶顶生，气生根系，着花1至数朵，多花种类着花数可达数十朵，花期因种而异，花色丰富而艳丽，花朵盛开时有特殊芳香，被誉为洋兰之王[1]，可作高级盆花和名贵切花，还可作为高雅美丽的胸饰花，观赏价值极高，深受世界各地人民的喜爱。卡特兰在我国未发现原生种分布，需从其他国家引种栽培，而引种栽培的卡特兰存在许多同种异名和同名异种现象，对我国卡特兰杂交育种的亲本选择造成了不利影响。已有研究表明，利用ISSR分子标记技术可对部分兰科植物进行遗传多样性分析及亲缘关系和品种鉴定[2-4]，但迄今关于卡特兰遗传多样性分子标记方面的研究报道较少。因此，应用ISSR分子标记技术对引种的卡特兰进行亲缘关系分析，对卡特兰原生种的分类、鉴定及杂交育种亲本选择具有重要意义。【前人研究进展】目前对卡特兰的研究主要集中于栽培技术[5]、组培快繁[6-8]、花期调控[9]和基因挖掘[10]等方面。Ziekienlcz等[11]、王少铭等[12]、杨和川等[13]研究认为，ISSR分子标记技术具有引物设计容易、操作简单、多态性好、可重复性高等优点。关于ISSR分子标记技术在其他兰类植物上的应用，何荆洲等[2]采用ISSR分子标记研究了36个蝴蝶兰品种的遗传关系；陈业等[3]采用ISSR分子标记对23种兜兰属植物亲缘关系进行分析；卢家仕等[4]采用ISSR分子标记研究了20份兰科植物的遗传多样性；黄晓慧等[14]利用ISSR分子标记技术对中国兰进行了PCR反应体系优化及引物筛选。李永清等[15]利用ISSR分子标记技术对36份铁皮石斛种质资源进行亲缘关系分析，发现在遗传相似系数0.700处可将铁皮石斛种质资源划分为6个类群。李宗艳等[16]利用ISSR分子标记技术分析7个硬叶兜兰(Paphiopedilummicranthum)居群的遗传多样性，发现7个居群聚为两类，居群间遗传分化与地理距离无显著相关性。李丽辉等[17]利用RAPD和ISSR分子标记技术对7种兰属(CymbidiumSw.)21个品种资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，发现21个兰属品种资源间遗传距离为1.910～6.600，聚类结果与传统形态学分类结果基本一致。【本研究切入点】目前，鲜见利用ISSR分子标记技术对卡特兰进行多样性亲缘关系分析的研究报道。【拟解决的关键问题】对18份卡特兰种质资源进行ISSR-PCR扩增及遗传关系和聚类分析，探究其亲缘关系和遗传特征，为卡特兰品种鉴定及杂交育种亲本选择提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

18份卡特兰种质资源均从国内外收集获得，种植于广西农业科学院花卉研究所种质圃，其基本信息见表1。

表1 用于ISSR分析的卡特兰信息

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取及检测 采用改良CTAB法分别提取18份卡特兰的基因组DNA[18]。用1.0 %琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和纯度，用TE缓冲液将提取的基因组DNA稀释至20 ng/μl，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物筛选及ISSR-PCR扩增 供试引物为加拿大哥伦比亚大学公布的第9套ISSR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，从中筛选出扩增条带清晰、稳定、多态性高的引物对样品进行PCR扩增。PCR反应体系20 μl：无菌水8 μl、2×TaqPCR Master Mix 10 μl、引物1 μl、模板DNA 1 μl。扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；72 ℃ 延伸7 min，产物4 ℃保存。取10 μl PCR扩增产物用于1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，最后用凝胶成像系统观察并拍照。

1.3 统计分析

根据扩增产物的电泳结果，凝胶上在相同迁移率位置上有条带的记为“1”，无条带的记“0”。将不同引物记录的条带构建[0，1]矩阵。试验数据采用NTSYS 2.10进行统计，采用非加权算术平均聚类(UPGMA)法进行聚类分析。用GenAlEx 6.51计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon信息多样性指数(I)和Nei’s遗传多样性指数(He)。

2 结果与分析

2.1 引物的多态性分析结果

从100条ISSR引物中筛选出6条扩增条带清晰、多态性高、重复性好的ISSR引物对18份卡特兰种质资源进行ISSR分析，结果(表2)表明，每条引物扩增产生的条带数在20～30条，平均为25.5条，6条引物扩增共获得条带153条，其中多态性条带为153条，引物平均多态性比率达100 %，说明18份卡特兰种质资源遗传多样性较丰富。图1为部分引物对供试样品的扩增结果。

表2 6条ISSR引物对卡特兰基因组DNA进行PCR扩增的结果

M：DL2000 Marker；1～18与表1编号相同M：DL2000 Marker；1-18 was the same as in table 1

2.2 卡特兰种质资源间遗传相似性分析结果

利用6条ISSR引物产生的标记信息，经NTSYS 2.10计算18份卡特兰种质资源的遗传相似系数，结果(表3)表明18份卡特兰种质资源的遗传相似系数为0.6514～0.8991。其中，遗传相似系数最小的是C3(Cattleyaguatemalensis)与C13(Cattleyaforbesii)，说明二者的亲缘关系最远，遗传差异相对较大；遗传相似系数最大的为C6(CattleyaBrazilian Jewel)与C8(Cattleyanobilior)，说明二者的亲缘关系最近，遗传差异相对较小。对遗传多样性参数的统计结果(表4)表明，Na为2.000个，Ne为1.207个，He为0.157，I为0.281，说明18份卡特兰种质资源间具有较丰富的遗传多样性。

表3 18份卡特兰种质资源的遗传相似系数

表4 18份卡特兰种质资源遗传多样性参数

2.3 18份卡特兰种质资源的聚类分析结果

为了确定各供试材料间的遗传关系，采用NTSYS 2.10对遗传矩阵进行UPGMA聚类分析，构建树状聚类图。从图2可看出，在遗传相似系数为0.749处，18份卡特兰种质资源可分为6大类，其中，第一大类包括C1、C12和C18，均为卡特亚属(Cattleya)，该属为单叶种，花朵较大；第二大类包括C2、C3、C10和C14，其中C2属于波浪边亚属(Crispae)，为卡特兰迷你原生种，植株矮小，单花，花大，C3、C10和C14属于圈聚花兰属(Guarianthe)，为双叶种，多花，花小；第三大类只有C5，属于类匈伯加亚属(Schomburgkoidea)，双叶种，花中等大小，花朵无斑点；第四大类包括C7、C9和C11，属于镰刀形花亚属(Falcata)，双叶种，花大且有斑点；第五大类包括C4、C13、C15和C16，属于因特美地亚属(Intermedia)，双叶种，一梗多花；第六大类包括C6、C8和C17，属于藕茎花亚属(Rhizantha)，该属植株矮小，花大，其中C6为C8与C17的杂交种，保留亲本C8的遗传物质较多。

图2 18份卡特兰种质资源UPGMA聚类分析结果Fig.2 UPGMA clustering analysis results of 18 Cattleya germplasm resources

3 讨 论

卡特兰原产于南美洲国家，其中文译名没有统一标准，不同学者针对同种卡特兰的中文译名存在较大差异，本研究的中文译名参照王雁等[19]的《卡特兰》一书。从分类角度分卡特兰有狭义和广义卡特兰，狭义卡特兰单指卡特亚属(Cattleya)，包括属内的原生种和属内种间的杂交品系，广义卡特兰泛指卡特亚属(Cattleya)及其他相关近缘属的所有原生种及杂交种。本研究的供试材料Guarianthebowringiana、Guariantheguatemalensis和Guarianthepatinii原为双叶种卡特亚属(Cattleya)的圈聚花兰亚属(Subgenuscircumvola)，2007年已变更属名为圈聚花兰属(Guarianthe)，成为独立属[1]，其余材料均为卡特亚属(Cattleya)。

由于卡特兰原生种资源缺乏的限制，目前国内开展分子标记研究仍属空白，但国外已有相关文献报道。Jin等[20]利用RAPD技术对25个卡特兰品种进行亲缘关系研究，通过分子聚类结果证实Cattleyawalkeriana与Cattleyanobilior分属于不同的种，而此前Cattleyawalkeriana曾被认为是Cattleyanobilior的一个种或Cattleyaloddigesii的杂种。本研究结果也表明，Cattleyawalkeriana与Cattleyanobilior为不同种，且其亲缘关系较近。目前形态学分类将Cattleyawalkeriana和Cattleyanobilior归为藕茎花亚属(Rhizantha)，分子标记结果与其形态学分类结果一致。Fajardo等[21]利用ISSR分子标记技术对巴西一种濒临绝种兰花Cattleyagranulosa及其他4种巴西本土种Brassavolatuberculata、Cattleyabicolor、Cattleyalabiata和Cattleyaschofieldiana的遗传多样性进行分析，结果表明ISSR遗传标记可有效检测卡特兰种间的遗传分化。而本研究聚类分析结果与形态学分类结果完全一致，与Fajardo等[21]的研究结果相符。Pinheirode等[22]利用RAPD和ISSR分子标记技术研究130个卡特兰样品，聚类分析结果表明所有样品可划分为5个类群，Cattleyalabiata与其他种间亲缘关系较远。本研究18份卡特兰种质资源在相似系数为0.749处被分为6大类，通过遗传相似性分析发现Cattleyaguatemalensis和Cattleyaforbesii亲缘关系最远，虽然二者均为双叶种，多花，但其亲缘关系较远，也为其隶属于不同的属提供了证据。CattleyaBrazilian Jewel是Cattleyanobilior与Cattleyawalkeriana的杂交种，与Cattleyanobilior的亲缘关系最近是因为其一半的遗传物质来源于Cattleyanobilior。

4 结 论

卡特兰种质资源间具有丰富的遗传多样性；UPGMA聚类分析结果与传统的形态学分类结果基本一致，18份卡特兰种质资源分别隶属于卡特亚属、波浪边亚属、类匈伯加亚属、镰刀形花亚属、因特美地亚属、藕茎花亚属和圈聚花兰属7个属。