濒危植物对节白蜡遗传多样性的cpSSR分析

郑鹏丽，程建如，周明芹

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆洲 434025)

【研究意义】对节白蜡(FraxinushupehensisChiú.Shang et Su)又名湖北白蜡，为木犀科白蜡属的落叶乔木，其生长缓慢、寿命长、树龄可达2000年以上，既是珍贵的用材树种，又是优美的园林绿化树种，还是极佳的盆景、根雕素材，被誉为“活化石”、“盆景之王”[1]。对节白蜡野生资源仅分布于钟祥市与京山县交界的大洪山余脉及周围相邻地区，分布范围狭窄，种群规模小，野生资源稀少，为中国第二批珍稀濒危保护植物[2]，被列入《中国植物红皮书》。【前人研究进展】目前， 国内外对对节白蜡研究主要集中在生物学特性[3]、人工栽培技术[4-6]、化学成分及药理作用与应用[7-8]等方面，遗传多样性与野生资源保护研究很少。【本研究切入点】叶绿体微卫星(chloroplast simple sequence repeat，cpSSR)是一种新型的标记技术，它不仅有SSR的优点，还能兼顾到cpDNA独立进化的特点[9]，目前已被广泛应用到植物种群遗传多样性[10]、种群结构分析[11]、种群分类[12]、系统地理分布[13]等方面研究。【拟解决的关键问题】本研究以来自京山和钟祥两地的10个对节白蜡天然居群共196个个体为材料，采用cpSSR分子标记方法对对节白蜡居群野生资源进行了遗传多样性分析，旨在从分子水平上揭示10个居群间对节白蜡的亲缘关系，为对节白蜡的生物多样性保护提供参考，并为cpSSR等分子技术在对节白蜡等濒危植物上的进一步研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究所用材料分别采自京山和钟祥两地的客店、鸡鸣寺、大口林场、虎爪山、孙桥、空山洞、雁门口、观音岩、永兴及杨集10个对节白蜡天然居群共196个个体。随机从距离至少10 m的成树上采集5 g当年生嫩叶，加适量变色硅胶后封口保存备用，种群编号及样品数分别为KD(16)、JMS(36)、DKL(6)、HZS(31)、SQ(19)、KSD(17)、YMK(21)、GYY(21)、YX(12)、YJ(25)(表1)，样本的数量反映了相应种群的大小。

表1 对节白蜡10个居群的样本及编号

1.2 DNA提取和cpSSR反应体系的建立

称取0.2 g干燥叶片，采用改良CTAB法[14]提取对节白蜡基因组DNA。cpSSR反应体系为7.5 μl 2×TaqMaster Mix、0.45 μl cpSSR primer(F)、0.45 μl cpSSR primer(R)、1 μl 模版DNA(20 ng/μl)、6.1 μl RNase-Free Water，反应总体系为15 μl。在PCR仪上扩增程序如下：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，最佳退火温度72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

由于cpDNA相对保守，cpSSR突变率较低，cpSSR引物的通用性较高[15]。故本研究从10对双子叶植物[16]和12对油橄榄[17]的cpSSR引物中筛选出6对能扩增出稳定且有多态性条带的微卫星引物(ccmp1、ccmp2、ccmp7、ccSSR8、ccSSR12、ccSSR20)用于对对节白蜡10个居群进行扩增，引物由北京天辉远生物公司合成。

1.3 数据分析

在电泳图谱中，同一位置的条带被视作一个位点，根据同一位置上是否有条带进行统计，有带的记为“1”，无带记为“0”。利用软件 POPGENE 1.31计算居群内及居群间的多态位点百分率(PPL)、等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei's基因多样性指数(h)、香农信息指数(I)、总的基因多样性(Ht)、物种基因多样性(Hs)、遗传分化系数(Gst)及基因流(Nm)、遗传一致度、遗传距离。用NTSYS-pc 2.10软件根据居群间的Nei's遗传一致度，对对节白蜡10个居群进行UPGMA聚类分析。

2 结果与分析

2.1 cpDNA遗传多样性分析

利用POPGENE 1.31对cpSSR标记扩增的结果进行遗传多样性参数的统计分析，筛选出的6对cpSSR引物共扩增了40条带，其中多态性带有30条，多态位点百分率为75.00 %。在居群水平上，PPL为7.50 %～55.00 %；Na为1.0750～1.5500，平均值为1.2575；Ne为1.0452～1.3124，平均值为1.1712；h值在0.0272～0.1850之间，平均值为0.0974；I值在0.0409～0.2802之间，平均值为0.1440。PPL、Na、Ne、h、I值最高的是鸡鸣寺(JMS)居群，最低的居群是观音岩(GYY)。对节白蜡种在物种水平上，Na、Ne、h、I平均值分别为1.7500、1.2756、0.1720、0.22732(表2)。cpDNA遗传多样性分析表明对节白蜡居群遗传多样性水平较低。

表2 cpSSR检测对节白蜡10个居群的遗传多样性分析

2.2 cpSSR遗传结构分析

据POPGENE 1.31显示分析，对节白蜡的Ht为0.1676，Hs为0.0974，Gst为0.4189。用AMOVA1.55软件包对所得数据进行方差分析，对节白蜡居群间的遗传多样性和居群内遗传多样性分别占总遗传多样性的41.89 %和58.11 %，表明对节白蜡遗传变异主要存在于居群内。Nm为0.6942，说明居群间基因交流不够丰富。

2.3 cpSSR遗传聚类分析

对节白蜡各居群间Nei’s遗传距离值的变化范围为0.0329 (KD、GYY)～0.1569(DKL、GYY)，平均值为0.0843；遗传一致度范围为0.8548(DKL、GYY)～0.9676(KD、GYY)，10个居群的遗传一致度平均值为0.9141(表3)。根据遗传一致度，用NTSYS-pc 2.10软件对对节白蜡的10个居群进行UPGMA遗传关系聚类分析(图1)。从聚类图可以看出，10个自然居群聚成4个大类：第I类包括5个居群，分别为客店、观音岩、虎爪山、杨集和雁门口；第 II类为孙桥和空山洞2个居群；永兴居群独成第III类；鸡鸣寺和大口林场2个居群构成第IV类。

表3 基于cpSSR标记的10个居群的遗传一致度和遗传距离

图1 根据 Nei’s遗传一致度构建的10个居群UPGMA聚类图Fig.1 The UPGMA dendrogram of the 10 populations based on genetic identity

3 讨 论

近年来，虽一些学者致力于研究濒危植物多样性，但这方面的研究仍然相对较少，分子标记等方法的运用将为野生遗传资源的保护提供更好的研究平台，在植物遗传多样性研究上将发挥更为重要的作用。对节白蜡作为我国特有的濒危物种，其应用价值极高，野生植物资源受到极大的破坏。因此，了解对节白蜡植物野生居群系统发育，进行遗传分析及鉴定，从种群基因层面制定出野生植物资源的保护性利用措施极为重要。

由于微卫星两侧的碱基序列具有很强的保守性，因此一个引物可以在另外一个物种上进行稳定扩增，称之为“种间扩增”。据研究，已开发的SSR引物具有较好通用性[18]，可以用于不同物种之间的扩增，如Weising等[19]报道了在烟草中成功扩增的10对cpSSR引物在猕猴桃科、桃金娘科、十字花科、龙舌兰科、蔷薇科、禾本科和豆科中扩增成功。本研究通过筛选已发表的cpSSR通用引物得到一些能稳定扩增的引物，但有部分引物多态性较低，难获得较高的多态性位点，而多态性高的引物可以得出较好分析结果。这与邓绍勇[20]对大青属9个种研究结果相似，表明尽管cpSSR引物的通用性较高，但由于植物亲缘关系较远会导致引物扩增的多态性降低。本研究结果显示：对节白蜡各居群的PPL平均值为25.75 %，h和I平均值为0.0974和0.1440，其中DKL、YX居群因其分布范围最小，样本数最少，群体比较小，致使个体间亲缘关系较近，遗传多样性水平较低。在物种水平上，PPL值有所提高为75.00 %，而h和I值分别为0.1720和0.2732，均高于居群的平均值，说明对节白蜡在物种水平上具有较高水平的遗传多样性。这与桃儿七[21]、榧树[22]的研究结果一致。

物种的遗传分化程度可以通过基因流反映出来，基因交换频繁的物种，其基因流大，居群间的遗传分化较小[23]。实验结果显示：Nm为0.6942(<1)，Gst为0.4189(>0.25)，表明对节白蜡自然居群间存在着极强的遗传分化趋势，这可能是对节白蜡繁育方式为异交，虫媒传粉影响了基因流的传播距离，致使长时间的地理隔离产生，花粉和种子在居群间的传播较为困难，居群交流频率较低。此外，对节白蜡居群间的遗传多样性和居群内遗传多样性分别为41.89 %和58.11 %，遗传一致度较高(0.8548～0.9676)，其原因可能是对节白蜡以前是一个完整的自然居群，由于人类活动的破坏了对节白蜡林，其自然居群数量减少，呈片段化分布，但在大型林场或自然保护区内的大量对节白蜡自然种群得以完整保存，地理距离相距较近的种群仍能有效的进行基因流的交换，使其遗传多样性在种群内较高。另一方面，对节白蜡树较为长寿，种子有深休眠的习性[5]，种群天然更新困难，导致其种群间遗传一致度较高。

对于10个对节白蜡自然居群，提出针对化保护建议：首先，对节白蜡的遗传变异主要发生在于居群内，因此要做好就地保护，保护其生存环境破不被破坏，保持居群大小和自然更新，并扩大种群规模。其次，对对节白蜡进行迁地保护，从多个居群中收集优质种质资源建立对节白蜡迁地保护林，加强保育遗传学的研究，更好的保护该物种各水平上的遗传多样性。最后，应积极开展其种子繁殖研究和人工繁殖技术和育苗，有效缓解人为过度破坏对天然种群生存的威胁。