野蚕豆根根腐病原菌、生物学特性及其有效杀菌剂研究

孔 琼，袁盛勇，郭建伟，周银丽，薛春丽，李 珣，罗武华

(红河学院生命科学与技术学院/云南省高校滇南特色生物资源研究与利用重点实验室，云南 蒙自 661199)

【研究意义】野蚕豆根(CentrantheragrandifloraBenth)又名大花胡麻草、化血丹，是玄参科(Scrophulariaceae)胡麻草属(Centranthera)多年生植物，分布海拔为500～1400 m的热带和亚热带地区，如越南、缅甸、印度，中国贵州、广西、云南等地，其中云南的文山、红河和屏边等地都有分布[1]。全草均可入药，其中根部入药较为普遍，具有散瘀止血、消肿止痛、活血调经等功效，在云南红河州等地主要用于心血管疾病的防治[2-3]。【前人研究进展】虽然该药主要是民间苗族用药，但随着国内外消费市场的需求，已经供不应求。自2014年以来，在云南屏边已有野蚕豆根人工栽培的成功案例，随着种植面积扩大和种植年限延长，多种病害也伴随而来。目前国内外对野蚕豆根的研究仅限于民间用药、化学成分、药效等方面[4-6]，有关病害种类、病原菌及防治方法均无相关报道。【本研究切入点】笔者于2015-2017年在云南屏边野蚕豆根种植基地田间调查发现，该药材在种植过程中常伴有白粉、霜霉、黑斑和根腐病害的发生，其中根腐病极为严重，对野蚕豆根的产量和品质造成了严重危害。【拟解决的关键问题】为了指导野蚕豆根田间种植中的病害防治，在云南野蚕豆根主栽培区屏边县采集根腐病害样品，进行病原菌分离和鉴定，研究了病原菌的生物学特性，并对多种药剂进行室内测定，以期为该病害的田间防治提供理论依据和方法。

1 材料与方法

1.1 病原菌鉴定

采用组织分离法进行病原菌分离，并用柯赫氏法则进行致病性验证[7]。纯化后的菌种，参照《植物病原真菌学》[8]和《镰刀菌属》[9]进行种类鉴定。

1.2 病原菌生物学特性研究

采用在PSA平板上培养5 d的菌种进行下列实验，其菌丝块大小为5 mm×5 mm；培养条件为27 ℃恒温暗培养(1.2.3和1.2.5除外)；培养基为PSA平板(1.2.1和1.2.2除外)。菌落直径采用十字交叉法测定；产孢量测定：切取培养后4 mm×4 mm菌丝块1块，用2 mL无菌蒸馏水稀释，用血球计数板计量产孢量。试验数据用DPSv7.05进行方差分析，再用Duncan法进行多重比较，数值表示为平均值±标准差。

1.2.1 不同培养基对根腐病病原菌落生长及产孢量影响 将菌丝块分别接入3种不同培养基(表2)，后置于27 ℃恒温暗培养，5 d后测量菌落直径和产孢量。

1.2.2 不同碳氮源对根腐病病原菌落生长及产孢量的影响 以Czapek培养基为基本培养基，分别用30 g葡萄糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉作为碳源，配制成含不同碳源的培养基；同时分别用2 g的硝酸钾、尿素、硝酸铵、硫酸铵作为氮源，配制成不同氮源的培养基。在上述不同培养基中接入菌丝块，每个处理3次重复，5 d后测定菌落直径和产孢量。

1.2.3 温度对根腐病原孢子致死温度、菌丝生长和产孢量的影响 菌丝生长温度范围：将菌丝块接种于PSA平板中央，于5、10、15、20、25、30、35 ℃温箱中暗培养，每个处理重复3次，5 d后测量菌落直径和产孢量。

孢子致死温度：将配成的孢子悬浮液放入玻璃试管中于温度为40、45、50、55、60 ℃的水浴锅内处理10 min，分别取1 滴孢子悬液于凹玻片上，快速风干后于27 ℃恒温保湿暗培养24 h后观察孢子萌发情况。根据试验的具体情况，进一步按l ℃梯度设计温度，最终确定孢子的致死温度。

1.2.4 pH对根腐病病原菌丝生长及产孢量的影响 用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH将灭菌后的PSA平板pH值调为5、6、7、8、9、10、11、12，并在平板中央接入菌丝块，每个处理重复3次，5 d后测量菌落直径和产孢量。

1.2.5 光周期对根腐病病原菌丝生长及产孢量的影响 菌丝块接入PSA平板中央，置于全光照、光暗交替(L/D=12 h/12h)、和全黑暗条件下进行恒温培养，5 d后测量菌落直径和产孢量。

1.2.6 不同湿度对根腐病病原菌分生孢子萌发的影响 参考方中达的《植病研究方法》中小容器空气湿度调节的方法[7]。在密闭容器中将相对湿度分别恒定在50 %、65 %、75 %、90 %和100 %，取1滴孢子悬液于无菌玻片上，快速风干后于不同湿度下25 ℃恒温暗培养24 h，统计孢子萌发率，每个处理3次重复。

1.3 室内药剂筛选

将10种杀菌剂(表1)配制成含不同浓度的含药固体PSA平板，接入菌丝块，7 d后测量菌落直径，设不含药PSA为空白对照，3次重复，计算相对抑制率。

表1 10种供试药剂

相对抑制率(%)=[(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)÷对照菌落生长直径]×100[10]所得经Finney几率分析法和DPS统计软件进行数据处理，求出各杀菌剂的毒力回归方程、EC50及相关系数(r)。

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

根腐病发生后，地上植株表现为萎蔫，最终枯死；地下根部变色，腐烂，无臭味。将分离后的菌种经柯赫氏法则验证后，证明编号为YCD-7菌种是引起野蚕豆根根腐的病原菌。该菌在PSA平板上生长迅速，气生菌丝薄绒状，浅灰色至淡蓝色，间有苍绿色的分生孢子座，初看像青霉菌污染(图1-A)；小型分生孢子多，呈卵圆形或肾形，无隔或偶有1隔，大小为10～20 μm×3.7～5 μm。大型分生孢子马特形，壁厚，3～5隔，大小为27～50 μm×3.5～5.7 μm(图1-B)；产孢细胞在菌丝上形成长筒形单瓶梗，少分枝，大小为62～200 μm×3～4 μm(图1-C)；大米培养物为玫红色(图1-D)。根据《植物病原真菌学》和《镰刀菌属》将该致病菌鉴定为茄病镰孢蓝色变种[Fusariumsolanivar.coeruleum(Sacc.)Booth]。

A：菌落形态；B：大、小型分生孢子；C：产孢结构； D：培养物在米饭培养基上的色泽 A: Colony morphology on PSA medium; B: Microconidia and macroconidia; C: Sporogenous structure; D: Color of pathogen on rice medium

2.2 病原菌生物学特性研究

2.2.1 不同培养基对根腐病病原菌丝生长和产孢量影响 不同基本培养基对野蚕豆根根腐病原菌菌丝生长和产孢量具有不同的影响(表2)。其中查氏培养基上的菌丝生长最快，菌落直径最大，但与PSA和PDA的处理差异不显著；而在PSA平板上的产孢量最大，为(2.86±0.03)× 107个/mL，与其他2种培养基的处理差异显著。因此，PSA培养基适合野蚕豆根根腐病原茄病镰孢蓝色变种菌丝生长和产孢量的增加。

表2 不同培养基对根腐病病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.2.2 不同碳氮源对根腐病病原菌丝生长和产孢量影响 在供试的4种碳源中，以葡萄糖为碳源的培养基菌丝生长最快(表3)，菌落直径最大为(7.10±0.05)cm，其次为乳糖和可溶性淀粉，但3者间差异不显著；产孢量以麦芽糖为碳源的处理最佳为(2.42±0.03)× 107个/mL，与以可溶性淀粉为碳源的处理差异不显著，但2者显著高于葡萄糖和乳糖的处理。综合考虑，适合茄病镰孢蓝色变种病原菌的菌丝生长和产孢量增加的碳源为可溶性淀粉。

表3 不同碳氮源对野蚕豆根根腐病原菌丝生长和产孢量的影响

野蚕豆根根腐病原茄病镰孢蓝色变种菌对供试的4种氮源利用有一定的差异(表3)。适合病原菌菌丝生长的氮源为硝酸钾，菌落直径为(7.13±0.08)cm，其次为硝酸铵和硫酸铵，最差为尿素；而适合产孢的氮源为硫酸铵，产孢量最大为(2.49±0.02)× 107个/mL，显著高于其他3种氮源。

2.2.3 温度对根腐病原孢子致死温度、菌丝生长和产孢量的影响 病原菌在40、45、50 ℃水浴10 min均能萌发，但在55、60 ℃处理10 min后孢子不能萌发，因此在50～55 ℃间将温度梯度缩小为1 ℃，结果以55 ℃水浴10 min孢子不能萌发，说明该菌的孢子致死温度为55 ℃、10 min。

由表4可知，在处理的7个温度条件下，25 ℃处理下野蚕豆根根腐病原菌菌丝生长最快，菌落直径最大为(6.72±0.24)cm，显著高于其他6个处理；同时产孢量也达到最高，显著高于其他处理。但该菌在低温条件下，生长速度较慢，在5 ℃时，菌丝不生长和不产孢。野蚕豆根根腐病原菌菌丝生长和产孢适合的温度范围25～30 ℃。

表4 不同温度对根腐病病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.2.4 pH对根腐病病原菌丝生长和产孢量影响 从表5可知，茄病镰孢蓝色变种菌对酸碱度有较强的适应能力。以pH 8时，菌丝生长最好，菌丝直径最大，为(7.38±0.08)cm，显著高于其他处理，其次是pH 7的处理。相似的结果也表现于产孢量测定中。因此，pH 7～8是适合茄病镰孢蓝色变种菌菌丝生长和产孢的条件。

表5 不同pH值对野蚕豆根根腐病原菌菌落生长和产孢量的影响

2.2.5 光周期对根腐病病原菌丝生长和产孢量影响 由表6可看出，茄病镰孢蓝色变种菌在3种不同光照条件下，菌落直径差异不显著；但对产孢有一定的影响，其中连续光照处理下的产孢量显著高于其他2种光周期处理。所以连续光照有利于病原菌菌丝生长和产孢。

表6 不同光周期对根腐病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.2.6 不同湿度对根腐病病原菌分生孢子萌发的影响 湿度对野蚕豆根根腐病病原菌茄病镰孢蓝色变种的分生孢子萌发率的影响较大，各处理间的孢子萌发率差异显著，孢子萌发率与相对湿度呈正相关(图2)。分生孢子在相对湿度≥50 %时均能萌发，且当湿度为100 %时，分生孢子萌发率最高为(92.33±2.52) %，显著高于其他处理。

图2 不同湿度对根腐病病原菌分生孢子萌发的影响Fig.2 Effects of different humidity on conidia germination of Fusarium solani var.coeruleum

2.3 室内药剂筛选

通过菌丝生长抑制率法测定，发现10种杀菌剂对野蚕豆根根腐病原菌的抑制效果各不相同(表7)。其中尚果乳油和应得悬浮剂的抑制效果较好，其抑菌百分率分别为83.78 %和82.82 %，其EC50低于150 μg/mL，分别为100.94 和126.99 μg/mL；其次为扑海因可湿性粉剂、灰灭可湿性粉剂、甲基托布津可湿性粉剂和灵动水分散粒剂，EC50分别为204.39、231.58、257.79和284.31 μg/mL；效果最差为翠贝，EC50为367.57 μg/mL。

表7 10种药剂对野蚕豆根根腐病原菌的抑制效果

3 讨 论

根腐病是一种危害极大的土传病害，其病原主要有细菌、真菌和线虫，其中真菌引起的根腐病占2/3，主要有镰刀菌属(Fusariumsp.)、轮枝孢属(Verticilliumsp.)、丝核菌属(Rhizoctoniasp.)、疫霉属(Phytophthorasp.)、角担菌(Ceratobasidiumsp．)和球壳孢属(Macrophominasp.)等真菌，其中由各种镰刀菌引起的根腐病危害极大[11-14]。根据野蚕豆根的根腐病病原菌采集和病原分离鉴定，确定为茄病镰孢蓝色变种[Fusariumsolanivar.coeruleum(Sacc.)Booth]。通过对野蚕豆根根腐病致病菌菌株YCD-7的生物学特性观察，适合生长的培养基种类较多，在所测试的3种培养基中，PSA为最佳培养基，相似结果也表现于由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysprum)引起的白术根腐病中[15]。同时该菌生长的温度范围较广，最适温度为25 ℃；生长pH范围也广，最适为pH 7～8；对多种碳源均能利用，菌落生长和产孢的最适碳源为可溶性淀粉；对多种无机氮源也能利用，而菌落扩展的最适氮源是硝酸钾，产孢最适氮源为硫酸铵；菌丝在连续光照下生长最快，产孢量最高；分生孢子萌发需要在高湿条件下，湿度越高，萌发率越高，其致死温度为55 ℃、10 min。病原的生物学特性与野蚕豆根根腐病易在屏边种植基地常年发生有关，且多发于多雨夏季的6-8月。

菌丝生长速率法测定10种杀菌剂对野蚕豆根腐病原菌的室内抑制效果，差异较大，其中尚果乳油(氟硅唑)、应得悬浮剂(腈苯唑)和扑海因可湿性粉剂(异菌脲)的抑制效果较好，其EC50分别为100.94、126.99 和204.39 μg/mL，且前2种药剂都属于三唑类杀菌剂，而扑海因属于二甲酰亚胺类。大量研究发现三唑类农药对镰刀菌具有很好的抑制效果，如对葫芦砧木萎蔫病(Fusariumsolani)具有较好抑制效果的20 %硅唑·咪鲜胺水乳剂；抑制草莓枯萎病(F.oxysporum)的有效药剂25 %腈菌唑乳油；能明显抑制马铃薯枯萎病(F.oxysporum)的75 %肟菌·戊唑醇乳油[16-18]。甲氧基丙烯酸酯类的吡唑醚菌酯和嘧菌酯、吡啶基乙基苯甲酰胺类的氟吡菌酰胺很少用于该属病害的防治，这些药剂常用于灰霉病(Botrytiscinema)、白粉病(Erysiphesp.)和番茄漆斑病(Myrotheciumroridum)的防治中[19-20]。因此在田间药效防治试验之前，有必要进行病害病原菌鉴定和室内药剂筛选准备。

上述结果表明野蚕豆根根腐病原茄病镰孢蓝色变种的适应性强，能够利用多种碳氮源，生长和存活的温度及酸碱范围较广，喜中性偏碱性环境，高温高湿条件有利于该病的发生。因此在野蚕豆根种植过程中，可通过改变栽培环境、合理施肥、轮作或化学防治等方法来抑制病原菌的生长与产孢，从而减轻该病的发生。如选择地势较高的地块进行种植，有利于排水；选择酸性肥料进行施肥，以改善土壤的酸碱环境；也可在雨季来临之前用防效好的药剂进行灌根或喷雾等。

4 结 论

通过形态学、病害症状观察和柯赫氏法则，确定野蚕豆根根腐的致病菌是茄病镰孢蓝色变种Fusariumsolanivar.coeruleum，本论文是首次关于野蚕豆根根腐病的报道；同时获得了影响该菌生长的营养物质种类和环境因素，菌丝生长和产孢的最适合碳源为可溶性淀粉，最适合温度为25 ℃，最适pH为7～8，湿度对孢子萌发影响较大；室内药剂筛选出400 g/L氟硅唑、24 %腈苯唑和50 %异菌脲对野蚕豆根根腐病病菌菌丝生长抑制作用最强，可作为防治该病害的化学杀菌剂。