壮伟远盲蚓(Amynthas robustus)和南美岸蚓(Pontoscolex corethrurus)的人工生长繁殖及其对赤红壤碳氮磷素的影响

王皓宇，张 池，吴家龙，周 波，戴 军

(1.华南农业大学资源环境学院/广东省土地利用与整治重点实验室/国土资源部建设用地再开发重点实验室/农业部华南耕地保育重点实验室，广东 广州 510642；2.广东省生态环境技术研究所，广东 广州 510650；3.广东省土地开发整治中心，广东 广州 510635；4.广东省农业科学院茶叶研究所/广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东 广州 510640)

【研究意义】蚯蚓被称为是“生态系统的工程师”[1-2]，对有机物的分解和腐殖质的形成等养分循环过程、维持和提高土壤肥力、修复退化和污染土壤有重要影响[3-4]。蚯蚓的种类丰富，不同生态型的蚯蚓对食物的偏好具有明显差异[5]。内栖型蚯蚓主要生活在土壤5～15 cm土层，生物扰动能力高，偏好取食富含有机质的土壤，能够很好地将有机物和土壤混合，对土壤物理结构及养分循环都有显著的促进作用[6]。因此，探讨食土内栖型蚯蚓的生长繁殖条件及其对土壤的作用是生物修复土壤技术应用的关键[4,7-8]。已有的蚯蚓繁殖研究较多关注于表栖型蚯蚓赤子爱胜蚓、南美岸蚓的生长繁殖[9-13]。赤子爱胜蚓取食高腐殖物质，较难在土壤中长时间生存。南美岸蚓在华南地区分布较广，但其为入侵蚓种[14-15]，不适于大规模饲养和田间应用。因此，探明华南地区本土内层种蚯蚓的繁殖条件极其重要，国内却鲜有报道。【前人研究进展】李翰青[16]利用13C示踪的室内微宇宙实验分析了Pheretimacorethrurus对凋落物和赤红壤有机碳转化过程的调控作用。刘宾等[17]在实验室条件下探讨了威廉腔环蚓(P.guillelmi)红壤氮素肥力的影响。刘德辉等[18]通过盆钵生物试验研究了秉氏环毛蚓(P.pingi.)在有机物料(稻草、花生秸、油菜秸)的红壤共同作用下经过100 d的培养土壤全磷和有效磷的影响。【本研究切入点】目前华南地区特有蚓种A.robustus对华南地区酸性赤红壤碳氮磷素迁移转化的影响以及与P.corethrurus差异，至今仍不清晰。【拟解决的关键问题】探究P.corethrurus和A.robustus的最适有机物料，探究二者对赤红壤碳氮磷迁移转化的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试蚯蚓为广东优势蚓种P.corethrurus和A.robustus，二者均为内栖型蚯蚓，采自华南农业大学树木园内。所有蚯蚓在实验室稳定培养一周后，选取个体大小相似，具有成熟环的健壮蚯蚓约10 g·pot-1进行实验。供试土壤采自华南农业大学树木园内。样品自然风干后，过2 mm筛备用。其基本理化性质为：<0.002 mm黏粒含量为23.97 %±0.5 %，粉粒23.21 %±0.4 %，砂粒52.82 %±0.2 %，pH为4.25±0.02，有机碳和全氮分别为(26.98±0.69)、(1.85±0.05)g·kg-1，C/N为14.60±0.20。供试有机物料为牛粪和蘑菇渣，分别取自华南农业大学动科学院养殖场和广东某蘑菇生产企业种植平菇后的下脚料，牛粪、蘑菇渣腐熟自然条件下堆置后，风干磨碎筛备用。

1.2 研究方法

本研究通过添加不同有机物料(牛粪、蘑菇渣)混合土壤(2 kg)和接种蚯蚓(约10 g)进入塑料盆钵(16 cm×18 cm)进行室内培养实验。实验共设置9个处理，每个处理5个重复。各处理布置如表2所示。所有处理的土壤或有机物混合土壤基质均调节水分至田间持水量60 %，25 ℃稳定24 h后，在室温25 ℃湿度40 %的条件下进行蚯蚓接种和培养。在实验进行期间采用称重法调节土壤水分含量。不接种蚯蚓的对照处理也采用相同方法进行设置。随后在培养15、30、45、60、75、90 d时，进行破坏性采样，对蚯蚓生物量、数量进行统计。在90 d培养后对所有基质风干和研磨，分别过2和0.149 mm筛装袋备用，以便土壤的pH、有机碳、可溶性碳、全氮、碱解氮、全磷、有效磷的测定。

表1 供试物料基本理化性质

表2 蚯蚓接种试验设计方案

1.3 土壤理化性质测定方法

土壤pH测定选用pH 计电位法(1∶2.5 土水比)；土壤有机碳用K2Cr2O7外加热氧化法；可溶性碳为0.5 mol·L-1K2SO4浸提，重铬酸钾外加热法测定；全氮的测定采用凯氏消煮法；全磷测定采用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法；有效磷采用氟化铵-盐酸浸提后使用钼锑抗比色法；碱解氮采用碱解扩散法[19]。

1.4 数据处理

本次试验的数据主要使用SPSS16.0 和R统计软件的ade4程序包进行整理和统计分析。对于蚯蚓生长繁殖状况，主要通过方差分析(ANOVA)和邓肯多重比较来分析不同时期各处理对于蚯蚓生长繁殖的差异；培养结束后土壤的理化属性分析主要通过方差分析(ANOVA)对于不同处理间土壤的差异进行分析。主成分分析(Principal Components Analysis)通过在R中导入ADE-4软件包，将各处理中相互关联的多个变量合成少数独立而又能反映总体信息的指标，并应用置换检验(Permutation test)比较不同处理间生物质量综合特征的差异；多元数据分析结果利用二维空间载荷图和得分图直观而形象地进行反映，处理间的差异显著性水平用P=0.05表示。为了更直观和形象的表现各指标间的相互关系，采用可视化相关分析对各指标进行进一步分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理条件下蚯蚓的生长繁殖情况

2.1.1 不同处理对蚯蚓生长的影响 在培养的前90 d，不同处理中蚯蚓的生物量均随时间的增长呈先升高后下降的趋势(图1-a,b)。其中100 %S的处理中P.corethrurus接种15 d后总生物量随时间的延长而显著降低(P<0.05)。在培养周期内，蘑菇渣(PC3)和牛粪(PC2)处理P.corethrurus的生物量均高于空白处理(PC1)，且分别在第30和45天最高。第90天的生物量大小依次为：PC2>PC3>PC1，PC2处理蚯蚓生物量显著高于其他两种处理(P<0.05)。100 %S的处理中A.robustus在培养45 d时达到最大值。在培养周期内，牛粪(AR2)和蘑菇渣(AR3)处理的蚯蚓生物量均高于空白处理(AR1)，且均在75 d时有最大值，第90天的蚯蚓生物量大小依次为：AR2>AR3>AR1，AR2、AR3显著高于AR1(P<0.05)。P.corethrurus在不同处理条件下培养第45天的生物量分别为7.42、16.38、12.48 g，除PC1处理外，PC2、PC3处理蚯蚓生物量均显著升高，且各处理间差异极显著(P<0.001)。A.robustus在不同处理条件第45天AR2(15.61 g)和AR3(17.45 g)处理的蚯蚓生物量均高于AR1(14.04 g)(P<0.05)。

2.1.2 不同处理对蚯蚓繁殖情况的影响 从图1-c，d可看出,不同处理中P.corethrurus数量在培养周期内随时间的推移呈先平稳后下降的趋势，PC2与PC3处理差异显著(P<0.05)，处理PC2、PC1蚯蚓数量在30 d时有小的涨幅，之后随着时间的延长而递减；A.robustus随时间的延长变化相对平稳，处理AR1、AR3在45 d时出现数量下降趋势，而AR2数量在90 d内未发生变化。

图1 不同处理蚯蚓生长繁殖情况Fig.1 The growth and fecundity of earthworms under different treatments

2.1.3 不同处理下蚯蚓生物学特征的定量比较 如表3所示，在第90天时，PC2处理P.corethrurus的存活率显著高于PC3和PC1处理(P<0.01)。A.robustus接种90 d后存活率极高，且各处理间差异不显著，其中AR2处理存活率为100 %。培养结束后PC2处理P.corethrurus的失重率(18.44 %)显著低于PC3(55.36 %)和PC1(71.72 %)处理(P<0.01)。AR1处理A.robustus的失重率(7.40 %)显著高于AR2(-47.25 %)和AR3(-38.30 %)处理(P<0.05)。P.corethrurus在3种处理下最大单体重为PC3(0.60 g)>PC2(0.47 g)>PC1(0.34 g)，且各处理差异极显著(P<0.01)。A.robustus在3种处理下最大单体重分别为AR1(4.68 g)、AR2(5.30 g)、AR3(5.24 g)，各处理间差异不显著，AR2处理得到最大单体重。

表3 两种蚯蚓在不同物料中存活、生长情况的定量比较

2.1.4 2种蚯蚓生长特性主成分分析 如图2所示，第一主成分(Ax1)和第二主成分(Ax2)的累积方差贡献率达到99.7 %。其中：第一主成分(Ax1)的方差贡献率为93.3 %，与存活率、生物量和失重率密切相关(P=0.001)。蚯蚓处理PC和AR生物学性质差异主要体现在第一主成分上。相关分析结果显示(图5)：蚯蚓的生物量与存活率之间有显著正相关关系(P<0.05)，生物量与失重率之间有显著负相关关系(P<0.05)。

图2 生物学特征主成分分析Fig.2 Principal component analysis of biological properties in treatments

2.2 蚯蚓对土壤理化性质的影响

不同有机物料处理中不同蚯蚓对土壤pH影响有明显差异。由图3-a可以看出，在不添加物料的处理中，2种蚯蚓均使土壤pH增高，其中PC1和AR1处理的pH值分别高于不添加蚯蚓CK1处理0.31、0.27，且达到显著水平(P<0.05)。在添加牛粪的处理中，AR2的pH显著高于CK2处理0.17，而PC2的pH显著低于CK2处理0.66。在添加蘑菇渣处理中，两种蚯蚓活动均使土壤pH降低，PC3与AR3的pH和CK3处理相比分别下降0.32、0.38(P<0.05)。100 %S的处理中PC1、CK1的有机碳含量比AR1分别显著提高了3.34、2.06 g·kg-1(P<0.05)；5 %Ma+95 %S的处理中CK2有机碳含量最高，PC2和AR2有机碳含量分别比CK2显著降低了5.87、8.02 g·kg-1(P<0.05)；5 %Mc+95 %S的处理中PC3有机碳含量最高，比CK3和AR3显著增加了10.55、6.92 g·kg-1(图3-b；P<0.05)。对于可溶性有机碳，蚯蚓作用后的土壤可溶性有机碳均显著降低(图3-e；P<0.05)，与各自对应的空白处理相比较，5 %Mc+95 %S处理中蚯蚓活动后DOC含量下降率最大(PC3下降85.71 %，AR3下降93.23 %)，100 %S处理蚯蚓活动后DOC下降水平居于其次(PC1下降84.85 %，AR1下降87.88 %)，5 %Ma+95 %S处理DOC下降率最低(PC2下降72.04 %，AR2下降87.10 %)。全氮含量比较中其情况与有机碳变化趋势一致。100 %S的处理中PC1>CK1>AR1(P<0.05)；5 %Ma+95 %S的处理中CK2>PC2>AR2(P<0.05)；5 %Mc+95 %S的处理中PC3全氮含量最高，比CK3和AR3分别高出0.63、0.42 g·kg-1(图3-c；P<0.05)。对于碱解氮，100 %S的处理中添加蚯蚓的碱解氮含量均上升，PC1相比CK1处理提高72.8 mg·kg-1(图3-f；P<0.05)；5 %Ma+95 %S的处理中PC2、AR2处理碱解氮含量与CK2相比分别下降28、11.67 mg·kg-1。

有效磷比较中，100 %S的处理中添加蚯蚓的有效磷含量均上升，且PC1处理的有效磷差异显著(图3-g；P<0.05)；5 %Ma+95 %S的处理中PC2、AR2处理有效磷含量与CK2相比都有下降，AR2下降达到极显著差异(P<0.01)；5 %Mc+95 %S的处理中PC3、AR3处理有效磷含量低于CK3处理，并且有达到极显著差异。对于碳氮比，100 %S的处理中各处理碳氮比无显著差异(P>0.05)；5 %Ma+95 %S的处理中PC2、AR2相比CK2分别减少了1.53、0.79，差异显著；5 %Mc+95 %S的处理中PC3、AR3相比CK3分别提高0.41、0.19但差异不显著(图3-h)。

图中白色柱代表不添加蚯蚓处理，灰色柱代表添加P.corethrurus，黑色柱代表添加A.robustus。大写字母表示同种蚯蚓在不同物料处理下在P<0.05水平下差异显著性；小写字母表示同种物料下不同蚯蚓处理在P<0.05水平下差异显著性

如图4所示，在主成分载荷图中(图4-a)第一主成分(Ax1)和第二主成分(Ax2)的累积方差贡献率达到74.0 %。其中：第一主成分(Ax1)的方差贡献率为61.4 %，与有机碳、全氮、全磷、有效磷、碳氮比、碳磷比和氮磷比密切相关(P=0.001)。第二主成分(Ax2)的方差贡献率为12.6 %，与碱解氮、可溶性有机碳密切相关(P=0.001)。通过主成分得分图(图4-b)可以看出同种物料处理条件下，不同种蚯蚓对土壤碳氮磷的影响差异主要体现在第二主成分上，主要在碱解氮和可溶性有机碳上体现差异。而同种蚯蚓在不同物料处理条件下对土壤碳氮磷的影响差异主要表现在第一主成分上，主要在有机碳、全氮、全磷、有效磷、碳氮比、碳磷比和氮磷比上体现差异。

图4 南美岸蚓和壮伟远盲蚓对土壤碳氮磷主成分分析Fig.4 Principal component of soil carbon,nitrogen and phosphorus were analyzed by P.corethrurus and A.robustus

图5中对角线的左下方，给出了2个属性的散点图，可以看到第4行第2列的散点图显示出有机碳和全氮具有很高的线性相关性。对角线的右上方，数字表示两个属性的相关性值，(最大值为1)，星号表示两者的显著程度。结果显示：有机碳、全氮、全磷、有效磷、碳磷比、氮磷比之间呈极显著正相关关系(P<0.001)；pH与有机碳、可溶性有机碳、全氮、碳氮比呈显著正相关(P<0.05)与全磷、有效磷、碳磷比、氮磷比呈极显著正相关关系(P<0.001)。

对角线上显示的是分布图；左下部显示的是具有拟合线的双变量散点图；右上部显示的是相关系数以及显著性水平，**表示相关性达到P<0.01显著水平；***表示相关性达到P<0.001极显著水平

3 讨 论

3.1 内层种蚯蚓的生长繁殖特征

本研究中的A.robustus和P.corethrurus是华南地区常见的2种蚯蚓[4，20]。A.robustus主要以土壤颗粒和有机物的混合物为食，一般活动于5～15 cm矿质土层。P.corethrurus广泛分布在泛热带地区，也是中国南岭以南地区唯一的外来入侵内栖型蚯蚓[14-15]。本研究显示南美岸蚓和壮伟远盲蚓的生长繁殖特征的异同之处。首先，添加有机物料都可以促进两种内栖型蚯蚓生长。从培养第15天开始，在土壤中添加5 %牛粪和蘑菇渣均能显著提高蚯蚓生物量。这与Barois等研究显示“与矿质土壤相比，添加有机底物喂养蚯蚓将会有更高的生长”的结果一致[21]。Lowe和Butt综述他人研究结果也得出内栖型蚯蚓喜欢取食混合有机物料的土壤，特别是有机物料聚集的地方[22]。因此，添加有机物料是饲养内栖型蚯蚓的关键。其次，添加有机物料的碳氮磷素化学计量特征影响内栖型蚯蚓的生长。本研究显示添加牛粪处理对P.corethrurus生长和维持生物量的效果最显著，而添加蘑菇渣处理对A.robustus生长和维持生物量的效果最显著。与蘑菇渣相比，牛粪C/N(14.9∶1)和C/P(71.6∶1)相对较低，表明有机物碳氮比和碳磷比的高低、特别是氮素和磷素是南美岸蚓生长的关键限制因素[12，23]。而壮伟远盲蚓能在添加较高碳氮比和碳磷比的蘑菇渣土壤中生存[8]，表明其生长主要受碳素的影响，氮素和磷素对它的限制作用不强。再次，蚯蚓生长特征差异与蚯蚓自身的取食和消化生理特征密不可分[12]。本研究试验期为90 d，有机物料于试验初期一次性加入土壤，2种内栖蚯蚓则以相同的生物量但不同数量接种至培养基质。由于与A.robustus相比，P.corethrurus体积小，因此其在盆中的接种数量大，种间竞争激烈。随着培养时间的增长，P.corethrurus在试验后期生物量急剧下降。García和Fragoso[12]在用不同植物残体等有机物(菌类、木屑、可可树)混合土壤饲养南美岸蚓的实验中也发现在45 d培养时间后南美岸蚓生物量开始下降。物料中生物可利用养分的缺乏也许是造成这种现象的原因。而A.robustus则在同样条件下则能正常生长。这也进一步表明P.corethrurus属于多腐殖质亚型(polyhumic)内栖型蚯蚓，而A.robustus属中腐殖质亚型(mesohumic)内栖型蚯蚓。对P.corethrurus进行饲养，必须不断添加高腐殖质有机物料，保持其生长所需；而对于A.robustus饲养，则低腐殖质也可满足其生长。另外，对于蚯蚓繁殖来讲，其受蚯蚓自身品种、接种密度、培养基质种类、形态和养分、环境温度和湿度等多种原因影响。内栖型蚯蚓与表栖型蚯蚓比较，其本身的繁殖率相对较低[24]，因此目前国内外成功繁殖内栖型蚯蚓的研究十分少[13]。本试验研究显示仅有P.corethrurus在培养30 d时5 %牛粪处理的蚯蚓数量有小幅度的增长。P.corethrurus作为华南地区唯一的外侵型蚯蚓，其对环境较强的适应性和抗干扰性是促成外来种大量繁殖变为优势种的重要原因[25-26]。但是，入侵蚓进入自然环境容易抢夺其他土著蚓的食物和空间，造成本地生物的减少和灭绝，导致生态系统凋落物分解、养分循环和植物生长等一系列变化[27]。因此，对于内栖型蚯蚓的人工繁殖，仍建议采用本地蚓种进行。

3.2 不同种类蚯蚓对添加不同有机物料赤红壤pH和碳氮磷素转化的影响

蚯蚓活动能够显著影响土壤pH值[4]。本研究结果显示，接种南美暗蚓和壮伟远盲蚓均使未添加有机物料处理pH显著提高了0.31和0.27个单位，接种壮伟远盲蚓使添加牛粪的土壤pH提高了0.17个单位。前人研究也证实[28]：在酸性旱地土中(pH 4.25)，接种南美岸蚓、壮伟远盲蚓后，土壤pH值显著提高0.2～0.8个单位，而且两者均使土壤趋于中性。南美岸蚓能够调节土壤酸碱性的原因可能是其具有发达的钙腺，能够调节自身对土壤酸度的耐受能力[29]。而对于壮伟远盲蚓，由于其不具备钙腺[30]，提升土壤pH可能与皮肤或肠道分泌Ca2+、Mg2+、K+等盐基离子有关[28]。但是随着有机物料和蚯蚓同时添加入土壤中，南美岸蚓和壮伟远盲蚓分别对牛粪和蘑菇渣具有较强的分解能力，大量有机酸物质的产生也许是造成土壤pH的明显下降的原因。

在土壤形成的过程中，内栖型蚯蚓的存在对有机质的影响显著。本研究在100 %土壤处理中，南美岸蚓和壮伟环盲蚓活动对土壤有机碳和全氮的影响差异较大。P.corethrurus可以提高未添加有机物料土壤中有机碳和全氮的含量，A.robustus的接种导致了其含量显著降低。由于在短时间内，内层种蚯蚓选择性取食土壤颗粒，受肠道消化研磨作用影响，新鲜蚓粪中有机质的分布发生变化，随之带来土壤粗颗粒中的有机质显著下降，而细颗粒中的有机质趋于增加[31]。崔莹莹[32]研究证实壮伟远盲蚓接种后未添加有机物料的土壤中>2000 μm团聚体比例显著大于南美岸蚓，2000～250 μm团聚体比例前者显著小于后者。因此，本研究中，与南美岸蚓相比较，壮伟远盲蚓更喜欢取食粗颗粒土壤，这些土壤颗粒上的有机质优先被消化分解可能是A.robustus接种造成土壤有机质显著下降的原因。可溶性碳，碱解氮和有效磷是土壤中生物最容易利用的形态。在100 %土壤处理中，P.corethrurus作用提高了土壤碱解氮和有效磷的含量。南美岸蚓通常分泌大量富氮分泌物[24，33]以及某些特殊功能菌促进土壤磷酸酶产生和加速有机磷的矿化可能是导致上述现象的原因[34-35]。

在添加有机物料处理中，土壤全量碳氮磷和有效态养分均显著增加。但是，当蚯蚓和有机物料同时添加后，各处理土壤碳氮磷的全量和有效态含量变化趋势不完全一致。全量养分的变化与添加有机物料的碳氮比和碳磷比有显著相关性。碳氮比和碳磷比相对较高的蘑菇渣和蚯蚓同时接种的处理中，蚯蚓活动显著促进了碳氮磷在土壤中储存。这一现象可能与体系中微生物生物量或种群结构的变化有关。通常土壤中细菌的碳氮比为5∶8，真菌的碳氮比为9∶ 15，而细菌的碳磷比通常也比真菌低得多。具有较高碳氮比(25.3∶1)和碳磷比(114.3∶1)的蘑菇渣加入后对体系内真菌的刺激作用会高于细菌。而真菌对底物的长期利用能力和原有碳的保持能力通常高于细菌[36]，碳磷比大时微生物也更容易固定磷[35]，因此蚯蚓作用后蘑菇渣土壤处理中有机碳氮磷处于相对较高的水平。同时，由于南美岸蚓是多腐殖质亚型内栖型蚯蚓，它具有相对较强的有机物料分解转化能力，因而有机物中较多的碳氮磷进入到到土壤中，造成土壤全量碳氮含量显著高于接种壮伟远盲蚓的土壤。对于有效养分，本研究结果显示随着外源有机物料和蚯蚓同时加入，土壤可溶性碳、碱解氮和有效磷含量均低于单独加入有机物料的处理，这可能与处理中蚯蚓和微生物竞争活性碳和有效氮磷养分有关。壮伟远盲蚓在蘑菇渣处理中活动促使土壤可溶性碳下降量远低于南美岸蚓处理，在牛粪中促使有效磷含量远低于南美岸蚓处理，蚯蚓对土壤全量碳氮磷的影响可能是上述变化原因。

4 结 论

C/N为14.9∶1和C/P为71.6∶1的牛粪更适宜南美岸蚓生长繁殖，而C/N为25.3∶1和C/P为114∶1的蘑菇渣更适合壮伟远盲蚓生长繁殖。单独接种南美岸蚓能够促进土壤全量氮和碱解氮、有效磷含量的增加；单独接种壮伟远盲蚓则显著降低土壤有机碳、全氮和可溶性碳含量。接种蚯蚓和添加有机物料联合作用时，南美岸蚓活动促进蘑菇渣处理中土壤全量氮和有机碳含量的增加，而降低牛粪处理中有机碳、可溶性碳、碱解氮含量；壮伟远盲蚓则降低牛粪处理中有机碳、全氮、可溶性碳、有效磷含量，蘑菇渣中可溶性碳和有效磷含量。

综上所述，内栖型蚯蚓活动能够影响土壤碳氮磷素养分的循环和转化。鉴于其为食土型蚯蚓，对土壤的物理影响也更为强烈，因此可以考虑将内栖型蚯蚓应用于修复理化质量下降明显的退化土壤当中。