云南烟草根际土壤真菌群落演替特征

李正风，钟 莉，朱 杰，唐 丽，吴 涛，廖头根，夏玉珍，杨利擎

(1.云南中烟工业有限责任公司技术中心,云南 昆明 650231；2.红云红河(集团)有限责任公司,云南 弥勒 652300;3.红塔烟草(集团)有限责任公司，云南 玉溪 653100；4.北京微普联合生物科技有限公司，北京 102200)

【研究意义】土壤是优质烟叶生产系统工程的基础，是影响烟叶质量的重要环境因素[1]。不同质地土壤的理化性状有显著差异，土壤机械组成、通透性、水分、温度和养分状况与烟叶生长发育和风格特色有着密切关系[2]。在烟叶种植过程中，植烟土壤由于长期使用化肥，导致土层板结，肥力下降，土壤微生物多样性减少，将严重影响烟叶品质[3-5]。如符菁等研究表明土壤施用复合微生物菌肥、光合菌剂均能提高土壤的酶活性[6]。所以，植烟土壤改良已受到烟草科研工作者们的高度关注。【前人研究进展】目前，通过改良植烟土壤来提高烟叶产量及品质的研究主要集中在耕作方式、土壤改良剂添加、不同肥料施用等对土壤肥力的改变方面 ，而有关烟草生产各阶段的土壤微生物群落结构及其动态变化以及土壤理化参数、肥力效果与微生物群落结构间的动态变化机制等还未进行系统深入研究。【本研究切入点】传统的真菌分类鉴定主要是以真菌的形态、生长以及生理生化等特征为依据。然而真菌的种类繁多，个体多态性不明显，个体的生长、生理生化特征也会随着环境的变化而不稳定。因此，采用传统的方法对真菌进行正确的分类存在较大的困难。随着分子生物学技术的发展，内部转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)高通量测序已被广泛的应用于真菌分类鉴定中[7-9]。ITS包含ITS1和ITS2两种，ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列的18S和5.8S之间，ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间，属于中度保守的区域，利用它可将真菌归类到种或亚种水平。而利用IonS5TMXL测序平台对ITS1或ITS2区进行单端测序，具有更长的读长、利于鉴定低丰度群落物种，且费用低，是研究真菌群落多样性的首选之策。【拟解决的关键问题】利用高通量测序技术，对云南7个地区不同肥力土壤中的真菌群落在烟草生长不同阶段的演替特征进行分析，并对土壤理化指标与微生物群落结构的关联规律进行探究，以期为植烟土壤、肥料的选择以及病害防治提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在云南省7个县(市)(昆明市宜良县、玉溪市华宁县、红河州弥勒县、玉溪市新平县、曲靖市陆良县、大理州南涧县、楚雄州楚雄市)，对植烟前(2018年3月)、团棵期(2018年5月)、成熟期(2018年6月)、成熟期(2018年9月)4个阶段不同肥力的根际土壤采用“S”形取样法，在每个采样区随机采集5个不同位点的土壤样品(表1)，等量混合后作为该单元的代表性样品。烟叶生长不同时期采集土壤样品时保持与上一次采样相同的地点进行。采集0～20 cm深的土壤，用PVC管进行打孔取样，可以保证每个点的取样深度和重量保持一致。每个采样单元采集大约取1 kg左右土样，如果采集样品太多，用“四分法”弃去多余土壤，最后用无菌自封袋包装，于-20 ℃保存，并带回实验室进行进一步的分析。

表1 土壤采样信息

1.2 理化参数的测定

在烟草不同生长时期(植烟前、团棵期、旺长期、成熟期)均采用多点取样法采集不同层次的土壤样品。将所采土壤样品带回实验室后自然风干，室温保存，用于检测土壤样品的理化性质(包括土壤酸碱度pH值、电导率EC值、速效氮、速效磷、速效钾、总碳、总氮、有机碳、有机氮)。其中pH值采用pH计法(水土质量比2.5∶1)测定，电导率EC值由EC计测定(水土质量比2∶1)，速效氮、速效磷、速效钾的测定分别采用碱解扩散法、碳酸氢钠法和醋酸铵法，总碳、总氮、有机碳、有机氮含量用元素分析仪测定。

1.3 DNA提取和高通量测序

采用MP FastDNA®Spin Kit for Soil试剂盒对土壤样本的基因组DNA进行提取。取适量样品DNA于离心管中，用无菌水稀释样品至1 ng/μl，使用带Barcode的特异性引物ITS5-1737F(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS2-2043R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)进行真菌内源转录间隔区(ITS,Internal Transcribed Spacer)PCR扩增。扩增得到的PCR产物利用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测。然后将PCR产物送至诺禾致源生物信息科技有限公司，利用Thermo Fisher Scientific的Ion S5 XL进行单端测序。

1.4 数据分析与处理

使用Cutadapt软件[10]过滤和按Barcode拆分样本后，通过UCHIME与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并去除其中的嵌合体序列，得到有效数据。利用Uparse方法进行OTU(Operational Taxonomic Units)聚类[11]，对每个OTU代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。

1.5 统计分析

对标准化后的样本相对丰度和物种数进行计算。为进一步探究分组样品间的群落结构差异，使用ANOSIM分析方法对分组样品的物种组成和群落结构进行差异显著性检验，通过NMDS降维图展示群落结构差异，并选用LEfSe算法计算各组中差异类群的LDA分值，对差异最显著的类群(LDA分值大于4)进行研究。使用RDA分析探索群落组成与环境因子之间的关系，并由向前选择(Forward Selection)得到显著影响群落变化的环境影响因子。

2 结果与分析

2.1 植烟前后土壤理化指标的变化

由表2可见，植烟前土壤的pH值多在4.5～5.5，团棵期较植烟前的pH值有所升高，达到烟草生长最适范围(pH5.5～6.5)，pH值的变化与肥料的施用有一定关系。土壤电导率呈现逐渐升高趋势(表2)。云南植烟土壤速效氮含量处于丰富水平，除新平土壤速效氮水平在适宜烤烟生产范围(45～135 mg/kg)内，其他地区都偏高。各地区速效磷分布不均，玉溪、陆良、昆明3地较适宜烤烟生产范围(10～35 mg/kg)偏高，其他地区都在适宜的范围内。多数地区速效钾含量高于适宜烤烟生产范围(120～200 mg/kg)，只有新平、玉溪两地在适宜范围内。楚雄和南涧土壤中的总碳、总氮、有机碳、有机氮含量都较其他地区高。

表2 各阶段土壤理化指标

2.2 植烟前后土壤真菌群落组成的变化

植烟前(3月)，土壤真菌群落相对丰度高的科是丛赤壳科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、Plectosphaerellaceae科、麦角菌科(Clavicipitaceae)、曲霉科(Aspergillaceae)(图1-A)。植烟前土壤中，相对丰度高的真菌属是镰刀菌属(Fusarium)、枝孢属(Cladosporium)、青霉菌属(Penicillium)、小不整球壳属(Plectosphaerella)、被孢霉属(Mortierella)等(图1-B)。

A为丰度最高的10个科；B为丰度最高的10个属。下同A is the 10 families with the highest abundance; B is the 10 genera with the highest abundance.The same as below

团棵期(5月)土壤真菌群落，相对丰度高的是丛赤壳科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、白蘑科(Tricholomataceae)、曲霉科(Aspergillaceae)等(图2-A)，相对丰度高的属是镰刀菌属(Fusarium)、香蘑属(Lepista)、被孢霉属(Mortierella)、链格孢属(Alternaria)等(图2-B)。

图2 团棵期土壤真菌优势类群Fig.2 The most abundant fungal taxa in the soil during rosette stage

旺长期(6月)，土壤真菌群落相对丰度高的科是丛赤壳科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、Trimorphomycetaceae科、毛壳菌科(Chaetomiaceae)等(图3-A)，相对丰度高的属是镰刀菌属(Fusarium)和Saitozyma属等(图3-B)。

图3 旺长期土壤真菌优势类群Fig.3 The most abundant fungal taxa in the soil during vigorous growing stage

成熟期(9月)，土壤真菌群落相对丰度高的科是丛赤壳科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛壳菌科(Chaetomiaceae)、Trimorphomycetaceae科、暗球腔菌科(Phaeosphaeriaceae)等(图4-A)，相对丰度高的属是镰刀菌属(Fusarium)、Saitozyma属、Setophoma属、被孢霉属(Mortierella)、锥盖伞属(Conocybe)等(图4-B)。

图4 成熟期土壤真菌优势类群Fig.4 The most abundant fungal taxa in the soil during mature stage

对植烟前及植烟后烟叶生长的3个阶段土壤真菌群落组成进行了比较分析，4个阶段土壤中真菌群落组成具有显著差异(表3)，其中植烟前与植烟后3个阶段土壤真菌群落组成的差异最为显著，旺长期与成熟期植烟土壤真菌群落组成差异最小(图5,表3)。

表3 不同阶段土壤真菌群落组成差异的ANOSIM分析结果

图5 不同阶段土壤样品中真菌群落MDS图Fig.5 MDS plot of fungal communities in the soil in different stages

LDA分析显示，植烟前，隶属于座囊菌纲(Dothideomycetes)、煤炱目(Capnodiales)、枝孢霉属(Cladosporium)的致病菌Cladosporiumchasmanthicola和小丛壳目(Glomerellales)、Plectosphaerellaceae科、小不整球壳属(Plectosphaerella)的Plectosphaerellacucumerina丰度显著高于植烟后的各个阶段(图6-A)。在植烟后的团棵期，植烟土壤中白蘑科(Tricholomataceae)、香蘑属(Lepista)的花脸香蘑(Lepistasordida)和格孢腔菌科(Pleosporaceae)的链格孢属(Alternaria)具有显著优势(图6-A、B)，但花脸香蘑(Lepistasordida)仅在昆明低肥力土壤中大量出现。在旺长期土壤中丛赤壳科(Nectriaceae)的镰刀菌属(Fusarium)具有显著优势(图6-A、B)。到了成熟期，粪锈伞科(Bolbitiaceae)、锥盖伞属(Conocybe)的大孢锥盖伞(Conocybemacrospora)以及丛赤壳科(Nectriaceae)、镰刀菌属(Fusarium)的尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)相比于其他3个阶段具有显著优势(图6-A、B)，大孢锥盖伞(Conocybemacrospora)仅在楚雄中等肥力土壤中大量出现。

不同阶段不同地区土壤中的真菌物种数通过比较显示，昆明土壤中的物种数较高，新平土壤中的物种数较低(图7)。

A：植烟前；B：团棵期；C：旺长期；D：成熟期。KM:昆明；YX:玉溪；CX:楚雄；LL:陆良；ML:弥勒；NJ:南涧；XP:新平A: Pre-planting stage; B: Rosette stage; C: Vigorous growing stage; D: Mature stage.KM:Kunming; YX:Yuxi; CX:Chuxiong; LL:Luliang; ML:Mile; NJ:Nanjian; XP:Xinping

2.3 真菌群落与理化指标的相关性分析

通过RDA分析的向前选择确定土壤真菌群落的差异主要与土壤速效磷(AP)、有机氮(ON)含量以及土壤墒情(SM)有关。从不同阶段土壤真菌群落与环境因子的关系来看，植烟前和团棵期土壤中的有机氮和速效磷含量较高，土壤墒情较低，到了旺长期和成熟期，土壤有机氮和速效磷含量有所下降，土壤墒情有所升高，这显著影响了土壤真菌群落结构(图8)。

图8 土壤真菌群落与环境因子的RDA分析图Fig.8 RDA plot analysis of the relationship between the fungal communities in the soil and environmental factors

3 讨 论

土壤真菌群落的差异主要与土壤中的速效磷、有机氮含量以及土壤墒情有关。从不同阶段来看，植烟前和团棵期土壤有机氮含量较高，到了旺长期和成熟期有所下降；土壤速效磷在旺长期最高，成熟期最低。土壤有机氮含量的变化趋势主要与土壤施肥的时间有关，而土壤速效磷含量在旺长期升高很可能与土壤中解磷菌的作用有关。土壤墒情在旺长期和成熟期明显高于植烟前和团棵期，这与降水量有很大关系，云南省降水量一般在6-8月达全年最大。

各地区的土壤中优势真菌类群有所不同，但是病害菌——镰刀菌属(Fusarium)在各地区都是丰度最高的属。镰刀菌是一类世界性分布的真菌，可引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，能侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一[12]。研究发现，镰刀菌属在各地烟草根际土壤中的相对丰度与土壤肥力没有明显的相关性，高肥力和低肥力地区土壤中均有丰度较高的情况，但各地土壤中在烟草旺长期该属的丰度是最高的，因此烟叶旺长期是防治这类病害的最重要时期。

在不同阶段，土壤中的真菌群落组成以及主要病害种类均发生明显的变化。枝孢属(Cladosporium)的Cladosporiumchasmanthicola在植烟前土壤中的丰度显著高于植烟后的各阶段，如昆明、楚雄、陆良植烟前的土壤中。Plectosphaerellacucumerina的丰度也高于植烟后各阶段，如弥勒烟区该类群丰度均较高。Plectosphaerellacucumerina可侵染黄瓜、甜瓜、番茄、烟草等多种经济作物，导致果实、根、茎部的腐烂[13-14]。因此对该种病害要做好预防工作。在植烟后的团棵期，植烟土壤中的花脸香蘑(Lepistasordida)和链格孢属(Alternaria)为优势类群，其中花脸香蘑(Lepistasordida)仅在昆明低肥力土壤中大量出现，链格孢属(Alternaria)在团棵期玉溪高肥力土壤、南涧低肥力土壤以及新平中等肥力土壤中丰度较高。链格孢属(Alternaria)真菌具有发生种类较多，寄主范围较广，适应性较强等特点，大多数种类兼性寄生于植物上，引起多种经济植物病害。如Alternariaalternata可使烟草产生赤星病，是烟叶成熟期易发生的叶斑病，在云南赤星病发生面积达4万km2左右，对烟叶产量和质量造成较大影响。在云南烟叶旺长期烟草根际土中筛到一株Alternariaalternata真菌，这种真菌在云南植烟土壤中有较高的丰度，要加以重点防治。对赤星病可通过合理施肥、肥水调均、保持株间通风透光等措施预防和减轻其危害烟叶。在成熟期大孢锥盖伞(Conocybemacrospora)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)是优势类群，大孢锥盖伞(Conocybemacrospora)仅在楚雄烟叶成熟期的中等肥力土壤中大量出现，在烟叶成熟期昆明、玉溪、楚雄土壤中尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)丰度较高。尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)是烟草根腐病的致病菌，烟叶获取营养物质的源头和通道是烟草的根茎部分，而根茎病害的发生会严重影响烟草品质和产量，单一方法很难达到好的防治效果，要根据植烟地情况，科学协调农业防治、化学防治和生物防治措施，才能取得经济、有效的防治效果[15]。

在玉溪植烟前和团棵期的低肥力土壤和楚雄植烟前、团棵期和旺长期的低肥力土壤中青霉菌属(Penicillium)真菌都有较高的丰度，主要有草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)等，研究表明草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)菌株能够依靠自身的代谢产物溶解土壤中的难溶无机磷，在磷素的转化中起着非常重要的作用[16-17]。在烟叶团棵期，新平、玉溪2地高肥力土壤中有大量的被孢霉属(Mortierella)真菌，是土壤中的腐生性真菌，主要分布在植物根面上，对植物不具有致病性，其丰度随植物的生长逐渐上升，在植物营养生长高峰期活性最强，对纤维素、半纤维素、果胶物质等起分解作用，但也有研究表明被孢霉属(Mortierella)在染黑胫病的烟草根际土中丰度上升[18]。青霉菌属(Penicillium)、被孢霉属(Mortierella)与木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)同为在植物根系上生长的常见生态类群，这些真菌可通过产生抗生素、营养竞争、诱导植物产生抗性等方式来防治病害或抑制病原，对维持健康的植烟土壤环境有重要作用。

4 结 论

本研究分析了云南7个地区植烟地不同肥力土壤，烟株生长的4个阶段真菌群落动态及土壤理化指标与微生物群落结构的关系。通过研究显示，不同时期土壤真菌群落组成有显著变化，植烟前与植烟后各阶段的差异最为显著，真菌群落的演替与土壤速效磷、有机氮、墒情等密切相关。植烟土壤中真菌种类昆明土壤始终较高，而新平土壤始终较低。在不同阶段，Alternaria属、镰刀菌属(Fusarium)、Plectosphaerellacucumerina、Cladosporiumchasmanthicola、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)等的丰度具其优势真菌类群有显著差异。该项研究结果可为烟草种植土壤、肥料的选择以及病害防治提供借鉴。